Organización bioquímca de ftsz en sistemas mínimos de membrana y entornos citomiméticos aglomerados

Resumen

La división bacteriana es un proceso esencial estrictamente regulado en el tiempo y el espacio. En la mayoría de las bacterias, FtsZ es el principal componente de la maquinaria molecular de división, el divisoma. Esta proteína es una GTPasa con capacidad de autoensamblaje que interacciona con otros elementos formando un anillo dinámico en el centro de la célula. El primer complejo del divisoma es el proto-anillo que, en E. coli, está formado por FtsZ y sus proteínas de anclaje a la membrana, ZipA y FtsA. Los sistemas mínimos de membrana se han utilizado como soportes para reconstituir los elementos del proto-anillo con el fin de analizar sus propiedades funcionales en condiciones controladas. Trabajos recientes demuestran la importancia de la concentración superficial de los elementos del proto-anillo que se anclan a la membrana en la modulación del comportamiento de los polímeros de FtsZ. La reconstitución de divisomas funcionales también necesita reproducir el entorno intracelular aglomerado en el que tiene lugar la división. Se ha descrito que la condensación de FtsZ en estructuras supramoleculares se ve favorecida por la aglomeración macromolecular. Debido a que esta aglomeración puede conducir a fenómenos de separación de fases, el citoplasma puede contener microentornos en los que las proteínas y otros metabolitos se acumulan y realizan funciones especializadas. En la primera parte de esta tesis se describe la caracterización cuantitativa de la interacción entre FtsZ y ZipA en microesferas recubiertas de lípidos y bicapas lipídicas soportadas. El uso de microesferas permitió la caracterización de los complejos FtsZ-ZipA en el entorno de la membrana, mediante ensayos de sedimentación diferencial y espectroscopía de fluorescencia. Se observó que el equilibrio de unión de los filamentos de FtsZ inducidos por GTP con ZipA era saturable, mientras que la interacción de los oligómeros de FtsZ-GDP no lo era. La diferencia podría atribuirse a la distinta composición y propiedades de los oligómeros de FtsZ-GDP y de los filamentos de FtsZ-GTP formados en solución. Por otro lado, la reconstitución de la interacción ZipA-FtsZ en bicapas soportadas y su análisis mediante aproximaciones biofísicas permitió demostrar que la densidad del receptor modula tanto la unión de los filamentos de FtsZ inducidos por un análogo lentamente hidrolizable del GTP, GMPCPP, a ZipA como la organización de los polímeros en la membrana. Estos estudios también determinaron que la unión de FtsZ-GMPCPP a ZipA ocurre en dos fases que se corresponden con los diferentes modos de extensión del polímero: primero sobre la superficie y después hacia la solución. En la segunda parte de esta tesis, se analiza la influencia de los microcompartimentos carentes de membrana resultantes de la separación de fases sobre la organización espacial dinámica de FtsZ. Se observó que en sistemas modelo de dos fases acuosas FtsZ se acumulaba en una de las fases y/o en la interfaz, dependiendo de la composición del sistema y del estado de oligomerización de dicha proteína. La redistribución de los filamentos dinámicos de FtsZ tras la despolimerización sugiere que la proteína puede desplazarse entre microentornos en respuesta a cambios en su estado de asociación. La existencia de estos microcompartimentos en el citoplasma podría, por tanto, actuar como un factor modulador inespecífico de la función de FtsZ. Por último, se describe la encapsulación por microfluídica de FtsZ y un sistema de separación de fases dentro de microgotas estabilizadas por lípidos como modelo de citoplasma compartimentado. A partir de estas microgotas se prepararon vesículas gigantes permeables en las que se disparó la polimerización de FtsZ posteriormente mediante la incorporación de GTP. Estos nuevos procedimientos permiten la encapsulación de sistemas de dos fases en microgotas o vesículas gigantes con mayor rendimiento, homogeneidad y compatibilidad biomolecular que otros métodos previamente descritos.