Surfactant protein sp-d in the lung contextoligomerization, biological activity and protective role in lung homeostasis

Résumé

La proteína del surfactante SP-D es una colectina que forma parte del surfactante pulmonar. Su monómero (43 kDa) está formado por un dominio N-terminal, seguido de un dominio colagénico, que continúa con un dominio conector con una conformación de hélice superenrollada y acaba en el dominio de reconocimiento de carbohidratos (CRD), característico de las colectinas tipo C. La SP-D se encuentra N-glicosilada en una asparagina (Asn70) localizada en el dominio colágeno. Tres monómeros se unen dando lugar a trímeros a través del plegamiento y formación de una triple hélice de colágeno, con participación de los dominios conectores. Los trímeros son estabilizados por puentes disulfuro entre las cisteínas en los dominios N-terminales. La unión de trímeros da lugar a dodecámeros, estructuras con forma de cruz, y a oligómeros más grandes, con un número variable de trímeros, llamados ¿fuzzy balls¿ o estructuras tipo asterisco. Sin embargo, hasta la fecha se desconocen el tipo de interacciones implicadas en la oligomerización desde trímeros hasta los oligómeros grandes. La SP-D fundamentalmente participa en la defensa innata inmune en los pulmones. Reconoce patógenos invasores y desencadena diversas acciones para llevar a cabo su eliminación. Además, la proteína está implicada en la homeostasis del surfactante pulmonar. Muchos estudios se han llevado a cabo para encontrar qué dominios de la SP-D son esenciales para las diferentes funciones descritas. También se ha estudiado la actividad de las diferentes formas oligoméricas de la proteína, aunque no todas ellas han sido aisladas individualmente y evaluadas en los diferentes ensayos funcionales. Teniendo en consideración toda esta información, el principal objetivo de esta Tesis ha sido caracterizar las diferentes formas oligoméricas de la SP-D, así como el tipo de interacciones que participan en la ruta de oligomerización y la posible distinta actividad de estos oligómeros. Para ello se han empleado dos preparaciones de SP-D humanas y una forma recombinante de la SP-D humana (rhSP-D). Además, se ha estudiado el papel protector de la SP-D en la homeostasis pulmonar sobre la función biofísica del surfactante pulmonar en condiciones de inflamación pulmonar. Los resultados obtenidos han mostrado que la SP-D se ensambla en trímeros, hexámeros, dodecámeros y oligómeros grandes (fuzzy balls), siendo ésta la primera vez que los hexámeros son descritos como una forma oligomérica definida de la proteína. Se ha propuesto que los hexámeros son estados intermedios necesarios entre los trímeros y dodecámeros o fuzzy balls. Se ha visto que las interacciones no covalentes dirigen el proceso de oligomerización desde trímeros a formas superiores, teniendo lugar entre los dominios N-terminal y la zona cercana a éstos de los dominios colágeno. Además, se ha visto que los dodecámeros y los fuzzy balls son las estructuras más abundantes en rhSP-D y hSP-D, respectivamente, siendo esta distribución cuantitativa sensible a las condiciones del medio en el cuál se encuentra la proteína, por ejemplo, el pH. El aislamiento de trímeros, hexámeros y fuzzy balls ha permitido estudiar y comparar la actividad de estas diferentes estructuras, en funciones de la proteína que dependen del dominio CRD. En ensayos de agregación y unión a E. coli, los fuzzy balls han sido los oligómeros más activos, tanto en la proteína recombinante como en la nativa. Además, se ha visto que la afinidad de unión de trímeros y hexámeros a bacterias es similar, pero los trímeros no inducen agregación de bacterias, mientras que los hexámeros sí lo hacen. Por último, se ha visto que la SP-D puede modular la NETosis, que es uno de los mecanismos que poseen los neutrófilos para luchar contra patógenos invasores. Además, se ha visto que un exceso de NETs puede ser dañino para la actividad biofísica del surfactante pulmonar y, que la SP-D protege al mismo de la inactivación por NETs.