Estudio integral de la trichinellosis silvestre en Extremadura

Resumen

Se ha realizado un estudio integral de la trichinellosis silvestre en Extremadura. Para ello, se divide el trabajo en dos grandes bloques. Por una parte, un estudio experimental en jabali, que es uno de los principales hospedadores de Trichinella, no solo en Extremadura, sino en Espana e incluso Europa y que, a la vez, se encuentra poco estudiado. Por otro lado, se ha realizado un estudio epidemiologico de la trichinellosis en nuestra Comunidad Autonoma, estudiando hospedadores constatados como el cerdo, el jabali y el zorro, y posibles hospedadores como aves y mamiferos carnivoros silvestres. A partir de los resultados obtenidos, se elabora un mapa epidemiologico de Trichinella en Extremadura y un Plan de Lucha y Control frente a esta zoonosis. A su vez, en el estudio experimental, se realiza el metodo micro-ELISA indirecto de dobles anticuerpos, para observar su eficacia diagnostica comparada con la trichinelloscopia y la digestion pepsica. Tambien, se realiza la tecnica Western Blot como complemento al diagnostico inmunoenzimatico por ELISA y se analiza el cuadro lesional histopatologico que producen T. spiralis y T. britovi en el jabali, para tener un mayor conocimiento del desarrollo de la enfermedad. Por ultimo, tambien se lleva a cabo un estudio de la distribucion muscular y carga parasitaria en estos jabalies experimentales y se comparan esos resultados con los que se obtienen en el diagnostico directo de los casos positivos remitidos por los veterinarios del SES. Para el estudio experimental, se han empleado 40 jabalies procedentes de varias fincas de la provincia de Caceres, de ambos sexos, de una edad comprendida entre los 2 y los 18 meses al inicio de la experiencia y de unos pesos iniciales que oscilan entre los 3,95 kg y los 60 kg. Estos 40 jabalies se dividen en dos experiencias infectivas. Asi, 22 animales se utilizan para una infeccion experimental reciente y se sacrifican a los 125 DPI, y los 18 restantes son mantenidos en experimentacion por un periodo mayor de tiempo y se sacrifican entre los 201 y los 957 DPI. Del grupo de jabalies de infeccion reciente, cuatro jabalies son mantenidos libres de Trichinella como animales control, mientras que los otros 18 son divididos en dos grupos y se infectan con diferentes dosis (200, 1.000 y 20.000 L1 por animal) de Trichinella spiralis y Trichinella britovi. De cada jabali, se obtiene suero sanguineo los dias -5, 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 105 y 125 DPI. Por su parte, en los jabalies de infeccion prolongada, dos animales se utilizan como control y los 16 restantes son infectados con 10.000 o 20.000 L1 de T. spiralis o T. britovi, realizandose extracciones de sangre con periodicidad mensual. Los animales se sacrifican previo aturdimiento con pistola de bala cautiva, tras lo cual se realiza una necropsia reglada. El nivel de infeccion de cada animal es determinado por trichinelloscopia y digestion pepsica del diafragma. Ademas, se realiza estudio de la distribucion muscular, analizando la carga parasitaria del diafragma, los sublinguales, los maseteros, la paleta, los flexores-extensores toracicos, el lomo, los intercostales, los abdominales y el jamon. Los controles son diagnosticados como negativos tras la digestion de, al menos, 500 g de musculatura. Tras las digestiones individuales, se evidencia la relacion entre la dosis infectante administrada y las larvas por gramo obtenidas. Es resenable que los jabalies infectados con T. spiralis poseen una carga parasitaria muy superior a la obtenida en los animales infectados con T. britovi. Ademas, como musculo preferente en el tropismo larvario destaca el diafragma, seguido de los sublinguales y el masetero. Con el menor tropismo larvario se encuentran los intercostales. Otra generalidad observada, es una distribucion muscular mas irregular de L1 de Trichinella en los jabalies con bajas cargas parasitarias. Se realiza el metodo ELISA indirecto de dobles anticuerpos, de acuerdo a una estandarizacion previa, utilizando antigeno EBL y ES. Se incuban 100 �Êl en placas Micro-ELISA 96 de 300 �Êl de capacidad por pocillo, durante 4 horas a 37oC, con una concentracion antigenica de 3 �Êg/ml. Las muestras de suero son utilizadas a una dilucion 1/1.000 y el conjugado anti-pig IgG a una dilucion de 1/25.000. Como sustrato se utiliza TMB al 0,01% y H2O2 (3 �Êg/ml) en tampon citrato, frenandose la reaccion a los 8-10 minutos con H2SO4 3N (50 �Êl por pocillo). La densidad optica obtenida a 450 nm es transformada en porcentaje de reactividad con respecto a los sueros control positivo y negativo de cada placa con el objetivo de reducir la variacion entre placas. Los valores diagnosticos para cada antigeno, son establecidos en base a los limites de confianza del 90% y 99% de 1.844 sueros de jabalies procedentes de monterias de toda la region extremena, negativos a Trichinella spp. por digestion artificial de, al menos, 25 g de pilares de diafragma, determinandose asi tres categorias de resultados: animales negativos, dudosos y positivos. En los jabalies de infeccion reciente se observa que, ya en el 10 DPI, se produce un ligero aumento en el porcentaje de reactividad en algunos animales y con algunos antigenos; aunque los primeros incrementos significativos se evidencian entre los 15-20 DPI. Cuando la parasitacion muscular resulta muy escasa (en lotes infectados con 200 L1), se aprecia un retraso en el comienzo de la produccion de anticuerpos. En estas bajas parasitaciones, la mayor respuesta se obtiene sobre el 40-50 DPI en los jabalies parasitados por T. britovi y sobre el 90-125 DPI en los parasitados por T. spiralis. En los jabalies con cargas parasitarias altas (infectados con dosis de 20.000 L1), las maximas respuestas de anticuerpos coinciden en el tiempo con los jabalies infectados con bajas cargas (200 L1) pero el porcentaje de reactividad es mayor en los primeros, obteniendose en ciertas ocasiones el 120% de reactividad. Atendiendo a la evolucion humoral de las dos especies de Trichinella estudiadas, se puede observar un diferente patron cinetico, de manera que en los jabalies infectados con T. britovi, se obtiene un maximo de respuesta humoral sobre el 30-50 DPI y posteriormente esta respuesta desciende, mientras que en los infectados con T. spiralis la respuesta es mas lenta, aumentando paulatinamente hasta el dia de sacrificio. En los jabalies de infeccion prolongada, se observa que la persistencia de anticuerpos a DPI tan avanzados esta muy influenciada por la propia idiosincrasia de cada jabali, detectandose anticuerpos en jabalies que han conseguido calcificar las larvas musculares y, por el contrario, perdiendose la respuesta frente a parasitaciones que todavia presentan larvas viables en la musculatura. En estos jabalies, se ha realizado un ELISA, utilizando mezcla de antigenos de ambas especies de Trichinella, observandose que no se obtiene una mejora sustancial en el diagnostico, ya que los falsos negativos siguen sin ser correctamente diagnosticados. La existencia de leves parasitaciones por protozoos (Balantidium coli y Sarcocystis miescheriana), acantocefalos (Macracanthorhynchus hirudinaceus) y nematodos (Metastrongylus spp., Strongylida spp., Ascarops strongylina y Oesophagostomum dentatum) no producen reacciones cruzadas con Trichinella evidenciables capaces de alterar el resultado negativo de la tecnica ELISA. El Western Blot se ha realizado sobre los jabalies 23, 25, 30, 32, 34, 36, 37 y Control E, utilizando tanto antigeno EBL como ES. Ademas, se analizan por WB jabalies abatidos en monterias que dan un resultado negativo por digestion artificial pero que tienen reactividad alta por ELISA. La cantidad de antigeno que se emplea es de 1.000 �Êg para SDS-PAGE de antigeno EBL y 600 �Êg para SDSPAGE de antigeno ES. Este antigeno es diluido 1:4 con Sample buffer. Las muestras de suero son utilizadas a una dilucion de 1:8 en TBS-Tw20 caseina 3% y el conjugado anti-pig IgG a una dilucion de 1/500 en TBS-Tw20 caseina 3%. Como sustrato se utiliza Cloronaftol y H2O2 en una solucion de metanol y TBS, frenandose la reaccion mediante aclarados en agua destilada. Tras la realizacion del Western Blot, se aprecia una analogia evidente con la evolucion humoral evidenciada al realizar la tecnica ELISA en todos los jabalies, lo que demuestra la fiabilidad de los resultados obtenidos en ambas tecnicas. Aunque en el WB no existe un patron de reconocimiento homogeneo, destacan una serie de bandas aparentemente homologas al grupo de bandas referenciadas por otros autores como TSL-1. Para el Ag EBL T1, los pesos moleculares aparentes detectados en estas bandas han sido aproximadamente 75, 72, 62, 52 y 47 kDa. Por su parte, utilizando Ag EBL T3, para estas bandas destacadas se calculan unos pesos moleculares aparentes de 70, 60, 49, 45 y 42 kDa. Dada la precision de la curva patron, es posible que ambos grupos de bandas sean en parte homologos y las diferencias de escasos kDa sean mas aparentes que reales en algunos casos. Aparte de este bandeo destacado que aparece en todos los jabalies, se observan diferentes bandas de evolucion heterogenea. La utilizacion de Ag ES, revela un patron de reconocimiento antigenico menos numeroso, ya que, al 125 DPI, en la mayoria de los jabalies, se detecta este grupo de bandas de peso molecular medio. Los sueros de jabalies abatidos en monterias con una alta reactividad en la tecnica ELISA, pero negativos a la digestion de 25 g de tejido muscular, reaccionan frente a diversas bandas antigenicas por WB, en muchos casos con un patron comparable al observado en los jabalies de infeccion experimental, sugiriendo que podrian presentar una respuesta especifica frente a Trichinella a pesar de que la infeccion no es demostrable por metodos directos. De manera general, el bandeo obtenido en la mayoria de los jabalies abatidos en monterias, tiene bandas en comun con el patron antigenico observado en algunos jabalies experimentales. Por su parte, el estudio histopatologico revela el cuadro lesional derivado de la parasitacion por Trichinella en jabali, observandose principalmente alteracion a nivel de musculatura esqueletica. Asi, de manera general, el cuadro lesional en los diferentes organos de estudio (corazon, higado, pulmon, rinon, bazo, linfonodo e intestino delgado) es ligeramente mayor en los jabalies infectados por T. spiralis. A nivel muscular (diafragma), el infiltrado celular perilarvario esta formado principalmente por linfocitos y celulas plasmaticas, siendo ligeramente mayor alrededor de las larvas de T. britovi, aspecto que conduce a la presencia de calcificaciones larvarias en algunos jabalies. De manera general, la respuesta celular disminuye con el paso del tiempo. El estudio epidemiologico se ha realizado sobre diferentes hospedadores en el periodo 2001/2010. Asi, una parte importante de este bloque de estudio ha sido la recepcion y busqueda del parasito en zorros. En ellos, se ha detectado una prevalencia del 2,86%. Como musculos de diagnostico se ha utilizado principalmente flexoresextensores toracicos y se ha digerido una media de 25 g por animal. En estos animales se observa la presencia de T. britovi en mayor proporcion que la detectada en cerdos o jabalies, por lo que constituye su reservorio natural, no obstante, la presencia de T. spiralis en zorros va aumentando ocupando poco a poco el lugar de T. britovi. En el estudio de campo, tambien se ha realizado una busqueda del parasito en otros carnivoros y en aves. Estas muestras se han remitido desde el Centro de Recuperacion de Fauna Silvestre �gLos Hornos�h de Sierra de Fuentes, detectandose una garduna (Martes foina) positiva a T. britovi con una parasitacion de 2,72 LPG en miembro toracico y un carabo comun (Strix aluco) con una parasitacion de 0,898 LPG en musculo pectoral, en el que no se ha podido identificar la especie de Trichinella involucrada. Por ello, las prevalencias detectadas han sido del 2,63% en mamiferos silvestres (excluyendose el zorro) y del 0,14% en aves. Ademas, se han muestreado jabalies abatidos en monterias, detectandose un total de 13 casos positivos de 3.055 jabalies analizados (0,43%), determinandose que del 76,92% de los casos se aisla T. spiralis. Para obtener unos datos mas completos de los casos positivos a Trichinella en Extremadura, se nos remite desde el Servicio Extremeno de Salud todos los casos positivos detectados por los veterinarios oficiales. Asi, sabiendo los jabalies abatidos y los cerdos sacrificados en los diez anos de estudio, se puede establecer una prevalencia del 0,18% en jabali, del 0,0047% en cerdos de matanza domiciliaria y del 0,00011% en cerdos de matadero. En los dos hospedadores, la especie de Trichinella mas presente es T. spiralis, las cargas parasitarias mas habituales son las de 1-10 LPG y los musculos mas parasitados son el diafragma, el sublingual y el masetero, siendo interesante la importancia de la carga parasitaria detectada en jamon, paleta y lomo de estos jabalies de infeccion natural, y la distribucion mas irregular en los casos de bajas cargas parasitarias. Solo se han observado infecciones mixtas (T1+T3) en jabalies (2,3%). La tendencia observada en las especies de Trichinella implicadas conlleva un aumento de los aislados de T. spiralis en relacion a T. britovi, quedando esta ultima muy ligada a zonas de marcado caracter montanoso y silvestre. Se han observado como zonas de mayor prevalencia de la trichinellosis, las comarcas del Valle del Jerte, Sierra de Gata y La Vera, y las comarcas con mayor casuistica Las Villuercas, Los Ibores y Monfrague. En todas estas comarcas, el Plan de Lucha y Control disenado debe ser muy estricto. Este Plan de Lucha y Control conlleva una serie de actuaciones por parte del consumidor final de carne de cerdo y/o jabali, cazadores, gestores cinegeticos, ganaderos, veterinarios, administraciones publicas e investigadores. Como objetivo de dicho Plan, subyace la necesidad de una convivencia con el parasito bajo unos niveles de control que impliquen seguridad alimentaria.