Evaluación de crioprotectores alternativos, glicerol y antioxidantes en la congelación del eyaculado equino

Resumen

En la actualidad la congelación en el caballo es una técnica ampliamente demandada por la industria equina mundial. Gracias a ésta, es posible almacenar y conservar el material genético de caballos de un alto valor económico, ya sea por sus características morfológicas, importancia genética o los logros deportivos conseguidos. La utilización de esta técnica también se ha visto favorecida, por la supresión de las prohibiciónes impuestas por los libros genealógicos de diferentes razas a la utilización de la IA. Esta modificación de los reglamentos reguladores favorece el comercio internacional de dosis seminales de animales de élite. A pesar de esta situación y de las ventajas que ofrece la utilización de semen congelado, esta técnica no se encuentra exenta de problemas. De forma general, el caballo muestra una elevada variabilidad individual en la respuesta a la congelación de sus eyaculados. Siendo el origen de esta diferente respuesta a la congelación fundamentalmente genético, consecuencia de los esquemas de selección empleados en esta especie. La principal fuente de daños que afecta al espermatozoide equino durante los procesos de congelación y descongelación es el shock osmótico, responsable de la disminución de la viabilidad y fertilidad postdescongelación. En la presente Tesis Doctoral se llevó a cabo el diseño y desarrollo de un diluyente de congelación para semen equino, también la comparación de los efectos protectores del glicerol frente a la dimetilformamida y la combinación de ambos agentes. Se evaluó el efecto de la incorporación del hidroxitolueno butilado en el medio de congelación, así como la incorporación del BAPTA-AM como agente quelante del calcio intracelular también en el medio y el efecto sobre los diferentes parámetros espermáticos de la sustitución de medios una vez realizada la descongelación. Finalmente en el último trabajo, investigamos la presencia del TNF? y sus receptores en el espermatozoide equino. La congelación con el medio Cáceres® diseñado y desarrollado por nuestro laboratorio, mejoró la supervivencia espermática y reducir la variabilidad entre sementales; correlacionamos estos resultados con la reducción del shock osmótico producida por combinación de crioprotectores presentes en el medio. Las muestras congeladas con el medio Cáceres ®, también mostraron un elevado potencial de membrana mitocondrial, pudiendo ser atribuido, también, a la reducción del shock osmótico conseguida con nuestro medio, como en los casos anteriores. Continuando con el shock osmótico, se conoce que una de las principales fuentes de éste para el espermatozoide equino durante los procesos de congelación y descongelación, es el agente crioprotector permeable incorporado en el medio. Por ello, en nuestro segundo trabajo comparamos los efectos crioprotectores del glicerol frente a la DMF y la combinación de ambos. Los resultados obtenidos en este trabajo, mostraron que los mejores valores de motilidad y velocidad espermática se obtienen con los medios que incorporaban bien la combinación de ambos crioprotectores y por otro DMF al 4% como único agente. Siendo en los dos medios el porcentaje final de crioprotectores del 4%. En el caso de la viabilidad, integridad de membrana y potencial de membrana mitocondrial, los mejores resultados fueron obtenidos empleando el medio que incorpora un 4% de DMF como único crioprotector. Hecho importante es que de los siete sementales utilizados en el trabajo, seis eran considerados como malos congeladores, grupo en el que existe una mayor sensibilidad de sus eyaculados al shock osmótico, de ahí su mejor respuesta a la congelación empleando la DMF como único crioprotector. Los daños letales y subletales sufridos por el espermatozoide durante el proceso de criopreservación, se relacionan con la peroxidación lipídica de la membrana plasmática. Por ello, en nuestro tercer trabajo, nos pareció importante estudiar el efecto de la incorporación del antioxidante liposoluble BHT en el medio de congelación. Los resultados obtenidos tras esta incorporación, no mostraron mejoras significativas en ninguno de los parámetros evaluados postdescongelación, al incorporar este agente a una concentración de 1 mM en el medio. En el cuarto trabajo nos propusimos estudiar el efecto de la incorporación en el medio de congelación del quelante intracelular de calcio BAPTA-AM, y posteriormente evaluar el efecto en los parámetros espermáticos de la sustitución del medio tras la descongelación. Los resultados obtenidos en la primera parte del trabajo, no mostraron efecto alguno de la incorporación del BAPTA-AM sobre la calidad seminal. Mientras que los obtenidos en la segunda parte del trabajo, mostraron una mejora de los parámetros de motilidad y cinética espermática así como del porcentaje de espermatozoides vivos, tras la sustitución del medio que incorporaba el quelante por el medio Tyrodes. Por último, decidimos estudiar la presencia del factor de necrosis tumoral alfa (TNF?) y sus receptores (TNF-R1, TNF-R2), en el espermatozoide equino. Esto se llevó a cabo en muestras de semen fresco y congelado, evaluando de este modo si los procesos de congelación y descongelación afectan a su expresión. En las muestras de semen fresco se detectaron las tres formas del TNF?, mientras que en congelado sólo se detectó la forma soluble además de una reducción de la intensidad de la banda correspondiente a la forma activa del TNF?. En el caso de los receptores, sólo se detectó TNF-R2, siendo esta la primera vez que se observa la presencia de este receptor en el espermatozoide equino.