Envejecimiento molecular del espermatozoide equino tras la eyaculaciónaplicación a nuevos métodos de conservación de semen

Resumen

INTRODUCCIÓN: Las primeras inseminaciones con semen fresco en el ganado equino se realizaron de la mano de Ivanov a principios del siglo del XX en Rusia. La tecnología reproductiva en el caballo se ha desarrollado prácticamente en las últimas dos décadas, principalmente, debido a las restricciones de los libros genealógicos de las diferentes razas. Actualmente la raza Pura Sangre Ingles sigue sin permitir el empleo de técnicas de reproducción asistida como la inseminación artificial (tanto con semen fresco, como con semen refrigerado) o la transferencia de embriones. En el Pura Raza Español no es hasta el año 2002 cuando se autoriza la utilización de este tipo de tecnologías, y solamente con ejemplares calificados (APA/3319/2002, de 23 de Diciembre, publicada en el BOE del 31 de Diciembre de 2002. Estas restricciones han causado un retraso en la investigación en esta área, por lo que todo el desarrollo de estas biotecnologías ha estado sujeto a un gran empirismo. En la actualidad, la inseminación artificial con semen fresco o refrigerado se utiliza de forma rutinaria en la mayoría de las yeguadas, obteniendo un porcentaje de éxito igual o superior al de la monta natural. Además el uso de la inseminación artificial ha promovido un comercio de dosis tanto nacional como internacional, evitando el traslado de animales y facilitando la labor. El principal inconveniente que se presenta en el equino a diferencia de otras especies, es la gran variabilidad existente entre sementales con respecto a su capacidad de refrigeración. Este problema viene derivado del tipo de selección que se realiza en esta especie, basada en la búsqueda de unos determinados rasgos funcionales y morfológicos y descuidando la calidad seminal. El objetivo de la refrigeración del semen equino es prolongar su expectativa de vida, para poder así ser enviado al lugar donde se encuentre la yegua alojada. Sin embrago, el semen equino en refrigeración sólo dura viable unos cuantos días, incluso horas dependiendo del individuo. Durante la refrigeración el espermatozoide sufre un estrés por frío, ¿Cold shock¿, responsable de este descenso en la viabilidad. Además del shock térmico, el espermatozoide experimenta daños como la peroxidación lipídica, depleción de ATP, o contaminación bacteriana. Todos estos daños culminarán con la muerte del espermatozoide durante la refrigeración. En contra partida, aún no están del todo claros cuales son los mecanismos moleculares que desencadenan la muerte de los espermatozoides. Por ello en este trabajo nos centramos en estudiar las vías moleculares de muerte en el espermatozoide, lo que nos facilitara el entendimiento de las vías de muerte/supervivencia presentes en dicha célula, mejorando así las estrategias de almacenamiento del semen. DESARROLLO TEORICO: Mediante la utilización de la citometría de flujo y las técnicas de Western Blotting, así como con el análisis de las motilidades del espermatozoide nos propusimos evidenciar la maquinaria de muerte celular en espermatozoides. En nuestro estudio nos centramos en dos vias de muerte principales, la apoptosis, mediada por sus dos váas, (intrinseca y extrinseca) y nos propusimos investigar la existencia de la maquinaria de autofagia, ya que en espermatozoide equino no había ningún estudio al respecto. Una vez evidenciada la existencia de procesos similares a la autofagia y apoptosis, hipotetizamos en la existencia de vías de supervivencia celular. Mas concretamente en la via AKT/PI3K ya que tiene un papel directo en la apoptosis. A continuación se citan los artículos que componen este trabajo de tesis: 1. Gallardo Bolanos, J.M., et al., Autophagy and apoptosis have a role in the survival or death of stallion spermatozoa during conservation in refrigeration. PLoS One, 2012. 7(1): p. e30688. 2. Bolanos, J.M., et al., During cooled storage the extender influences processed autophagy marker light chain 3 (LC3B) of stallion spermatozoa. Anim Reprod Sci, 2014. 145(1-2): p. 40-6. 3. Gallardo Bolanos, J.M., et al., Phosphorylated AKT preserves stallion sperm viability and motility by inhibiting caspases 3 and 7. Reproduction, 2014. 148(2): p. 221-35. 4. Gallardo Bolanos, J.M., et al., Caspase activation, hydrogen peroxide production and Akt dephosphorylation occur during stallion sperm senescence. Reprod Domest Anim, 2014. 49(4): p. 657-64 CONCLUSIONES: El espermatozoide equino expresa proteínas implicadas en la vía de la autofagia.Estas proteínas (LC3B) se activan de diferente modo dependiendo de la fracción de espermatozoides que se considere y del medio de incubación. Aparentemente el mayor procesado de la LC3B se asocia con una mejor supervivencia espermática durante la conservación en refrigeración La inhibición de un mecanismo similar a la apoptosis, probablemente especifico del espermatozoide, participa en la supervivencia del espermatozoide equino tras la eyaculación El espermatozoide equino experimenta mecanismos similares a la apoptosis tras la eyaculación al mismo tiempo que se incrementa la producción de peróxido de hidrogeno y se defosforila la AKT BIBLIOGRAFIA 1. Amann, R.P., The cycle of the seminiferous epithelium in humans: a need to revisit? J Androl, 2008. 29(5): p. 469-87. 2. Dubowitz, N., et al., Aging is associated with increased HbA levels, independently of glucose levels and insulin resistance, and also with decreased diagnostic specificity. Diabet Med, 2014. 3. Johnson, L., D.L. Thompson, Jr., and D.D. Varner, Role of Sertoli cell number and function on regulation of spermatogenesis. Anim Reprod Sci, 2008. 105(1-2): p. 23-51. 4. Kimura, M., et al., Balance of apoptosis and proliferation of germ cells related to spermatogenesis in aged men. J Androl, 2003. 24(2): p. 185-91. 5. Heninger, N.L., et al., Germ cell apoptosis in the testes of normal stallions. Theriogenology, 2004. 62(1-2): p. 283-97. 6. Koji, T., Male germ cell death in mouse testes: possible involvement of Fas and Fas ligand. Med Electron Microsc, 2001. 34(4): p. 213-22. 7. Shaha, C., Modulators of spermatogenic cell survival. Soc Reprod Fertil Suppl, 2007. 63: p. 173-86. 8. Sofikitis, N., et al., Hormonal regulation of spermatogenesis and spermiogenesis. J Steroid Biochem Mol Biol, 2008. 109(3-5): p. 323-30. 9. Levy, R. and I. Seifer-Aknin, [Apoptosis during spermatogenesis and in ejaculated spermatozoa: importance for fertilization]. Ann Biol Clin (Paris), 2001. 59(5): p. 531-45. 10. Franca, L.R., G.F. Avelar, and F.F. Almeida, Spermatogenesis and sperm transit through the epididymis in mammals with emphasis on pigs. Theriogenology, 2005. 63(2): p. 300-18. 11. Olaciregui, M., et al., Cryopreservation of epididymal stallion sperm. Cryobiology, 2014. 68(1): p. 91-5. 12. Cornwall, G.A., H.H. Von Horsten, and S. Whelly, Cystatin-related epididymal spermatogenic aggregates in the epididymis. J Androl, 2011. 32(6): p. 679-85. 13. Gupta, S., Molecular signaling in death receptor and mitochondrial pathways of apoptosis (Review). Int J Oncol, 2003. 22(1): p. 15-20. 14. Fuentes-Prior, P. and G.S. Salvesen, The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition. Biochem J, 2004. 384(Pt 2): p. 201-32. 15. Mehlen, P. and D.E. Bredesen, The dependence receptor hypothesis. Apoptosis, 2004. 9(1): p. 37-49. 16. Kroemer, G., L. Galluzzi, and C. Brenner, Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol Rev, 2007. 87(1): p. 99-163. 17. Pavlov, E.V., et al., A novel, high conductance channel of mitochondria linked to apoptosis in mammalian cells and Bax expression in yeast. J Cell Biol, 2001. 155(5): p. 725-31. 18. Johnson, D.E., Noncaspase proteases in apoptosis. Leukemia, 2000. 14(9): p. 1695-703. 19. Suzuki, Y., et al., Mitochondrial protease Omi/HtrA2 enhances caspase activation through multiple pathways. Cell Death Differ, 2004. 11(2): p. 208-16. 20. Chipuk, J.E. and D.R. Green, Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell death? Nat Rev Mol Cell Biol, 2005. 6(3): p. 268-75. 21. Kroemer, G. and S.J. Martin, Caspase-independent cell death. Nat Med, 2005. 11(7): p. 725-30. 22. Susin, S.A., et al., Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor. Nature, 1999. 397(6718): p. 441-6. 23. Marchetti, P., et al., Mitochondrial permeability transition is a central coordinating event of apoptosis. J Exp Med, 1996. 184(3): p. 1155-60. 24. Krammer, P.H., et al., No life without death. Adv Cancer Res, 2007. 97: p. 111-38. 25. Paasch, U., et al., Activation pattern of caspases in human spermatozoa. Fertil Steril, 2004. 81 Suppl 1: p. 802-9. 26. Martin, G., et al., Phosphatidylserine externalization in human sperm induced by calcium ionophore A23187: relationship with apoptosis, membrane scrambling and the acrosome reaction. Hum Reprod, 2005. 20(12): p. 3459-68. 27. Said, T.M., et al., Advantage of combining magnetic cell separation with sperm preparation techniques. Reprod Biomed Online, 2005. 10(6): p. 740-6. 28. Said, T.M., et al., Effects of magnetic-activated cell sorting on sperm motility and cryosurvival rates. Fertil Steril, 2005. 83(5): p. 1442-6. 29. Grunewald, S., et al., Capacitation and acrosome reaction in nonapoptotic human spermatozoa. Ann N Y Acad Sci, 2006. 1090: p. 138-46. 30. Ortega-Ferrusola, C., et al., Detection of "apoptosis-like" changes during the cryopreservation process in equine sperm. J Androl, 2008. 29(2): p. 213-21. 31. Brum, A.M., K. Sabeur, and B.A. Ball, Apoptotic-like changes in equine spermatozoa separated by density-gradient centrifugation or after cryopreservation. Theriogenology, 2008. 69(9): p. 1041-55. 32. Sakkas, D., E. Mariethoz, and J.C. St John, Abnormal sperm parameters in humans are indicative of an abortive apoptotic mechanism linked to the Fas-mediated pathway. Exp Cell Res, 1999. 251(2): p. 350-5. 33. Sakkas, D., et al., Origin of DNA damage in ejaculated human spermatozoa. Rev Reprod, 1999. 4(1): p. 31-7. 34. Sakkas, D., et al., Abnormal spermatozoa in the ejaculate: abortive apoptosis and faulty nuclear remodelling during spermatogenesis. Reprod Biomed Online, 2003. 7(4): p. 428-32. 35. Sakkas, D., et al., The presence of abnormal spermatozoa in the ejaculate: did apoptosis fail? Hum Fertil (Camb), 2004. 7(2): p. 99-103. 36. Shaman, J.A., R. Prisztoka, and W.S. Ward, Topoisomerase IIB and an extracellular nuclease interact to digest sperm DNA in an apoptotic-like manner. Biol Reprod, 2006. 75(5): p. 741-8. 37. Shaman, J.A., Y. Yamauchi, and W.S. Ward, Sperm DNA fragmentation: awakening the sleeping genome. Biochem Soc Trans, 2007. 35(Pt 3): p. 626-8. 38. Ball, B.A., Oxidative stress, osmotic stress and apoptosis: impacts on sperm function and preservation in the horse. Anim Reprod Sci, 2008. 107(3-4): p. 257-67. 39. Taylor, S.L., et al., Somatic cell apoptosis markers and pathways in human ejaculated sperm: potential utility as indicators of sperm quality. Mol Hum Reprod, 2004. 10(11): p. 825-34. 40. Paasch, U., et al., Cryopreservation and thawing is associated with varying extent of activation of apoptotic machinery in subsets of ejaculated human spermatozoa. Biol Reprod, 2004. 71(6): p. 1828-37. 41. Grunewald, S., et al., Caspase activation in human spermatozoa in response to physiological and pathological stimuli. Fertil Steril, 2005. 83 Suppl 1: p. 1106-12. 42. Aquila, S., et al., Human sperm express a functional androgen receptor: effects on PI3K/AKT pathway. Hum Reprod, 2007. 22(10): p. 2594-605. 43. Bejarano, I., et al., Caspase 3 activation in human spermatozoa in response to hydrogen peroxide and progesterone. Fertil Steril, 2008. 90(4 Suppl): p. 1340-7. 44. Perdichizzi, A., et al., Effects of tumour necrosis factor-alpha on human sperm motility and apoptosis. J Clin Immunol, 2007. 27(2): p. 152-62. 45. Choi, Y.J., et al., Cytochrome c upregulation during capacitation and spontaneous acrosome reaction determines the fate of pig sperm cells: linking proteome analysis. J Reprod Dev, 2008. 54(1): p. 68-83. 46. Aitken, R.J., et al., Apoptosis in the germ line. Reproduction, 2011. 141(2): p. 139-50. 47. Aitken, R.J. and M.A. Baker, Causes and consequences of apoptosis in spermatozoa; contributions to infertility and impacts on development. Int J Dev Biol, 2013. 57(2-4): p. 265-72. 48. Aitken, R.J., K.T. Jones, and S.A. Robertson, Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health. J Androl, 2012. 33(6): p. 1096-106. 49. Aitken, R.J. and A.J. Koppers, Apoptosis and DNA damage in human spermatozoa. Asian J Androl, 2011. 13(1): p. 36-42. 50. Baker, M.A., et al., Proteomic insights into the maturation and capacitation of mammalian spermatozoa. Syst Biol Reprod Med, 2012. 58(4): p. 211-7. 51. Reid, A.T., et al., Cellular mechanisms regulating sperm-zona pellucida interaction. Asian J Androl, 2011. 13(1): p. 88-96. 52. Suarez, S.S., Control of hyperactivation in sperm. Hum Reprod Update, 2008. 14(6): p. 647-57. 53. Aitken, R.J., et al., Redox regulation of tyrosine phosphorylation in human spermatozoa and its role in the control of human sperm function. J Cell Sci, 1995. 108 ( Pt 5): p. 2017-25. 54. Ecroyd, H.W., R.C. Jones, and R.J. Aitken, Endogenous redox activity in mouse spermatozoa and its role in regulating the tyrosine phosphorylation events associated with sperm capacitation. Biol Reprod, 2003. 69(1): p. 347-54. 55. Boerke, A., et al., Involvement of bicarbonate-induced radical signaling in oxysterol formation and sterol depletion of capacitating mammalian sperm during in vitro fertilization. Biol Reprod, 2013. 88(1): p. 21. 56. Koppers, A.J., et al., Significance of mitochondrial reactive oxygen species in the generation of oxidative stress in spermatozoa. J Clin Endocrinol Metab, 2008. 93(8): p. 3199-207. 57. Aitken, R.J., The capacitation-apoptosis highway: oxysterols and mammalian sperm function. Biol Reprod, 2011. 85(1): p. 9-12. 58. Earnshaw, W.C., L.M. Martins, and S.H. Kaufmann, Mammalian caspases: structure, activation, substrates, and functions during apoptosis. Annu Rev Biochem, 1999. 68: p. 383-424. 59. Chekeni, F.B., et al., Pannexin 1 channels mediate 'find-me' signal release and membrane permeability during apoptosis. Nature, 2010. 467(7317): p. 863-7. 60. Pena, F.J., et al., A new and simple method to evaluate early membrane changes in frozen-thawed boar spermatozoa. Int J Androl, 2005. 28(2): p. 107-14. 61. Martinez, I.N., J.M. Moran, and F.J. Pena, Two-step cluster procedure after principal component analysis identifies sperm subpopulations in canine ejaculates and its relation to cryoresistance. J Androl, 2006. 27(4): p. 596-603. 62. Ortega-Ferrusola, C., et al., Identification of sperm subpopulations in stallion ejaculates: changes after cryopreservation and comparison with traditional statistics. Reprod Domest Anim, 2009. 44(3): p. 419-23. 63. Yu, L., L. Strandberg, and M.J. Lenardo, The selectivity of autophagy and its role in cell death and survival. Autophagy, 2008. 4(5): p. 567-73. 64. Yu, L., et al., Regulation of an ATG7-beclin 1 program of autophagic cell death by caspase-8. Science, 2004. 304(5676): p. 1500-2. 65. Moran, J.M., et al., Nitric oxide induces caspase activity in boar spermatozoa. Theriogenology, 2008. 70(1): p. 91-6. 66. Ortega Ferrusola, C., et al., Lipid peroxidation, assessed with BODIPY-C11, increases after cryopreservation of stallion spermatozoa, is stallion-dependent and is related to apoptotic-like changes. Reproduction, 2009. 138(1): p. 55-63. 67. Thomson, L.K., et al., Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod, 2009. 24(9): p. 2061-70. 68. Pujianto, D.A., B.J. Curry, and R.J. Aitken, Prolactin exerts a prosurvival effect on human spermatozoa via mechanisms that involve the stimulation of Akt phosphorylation and suppression of caspase activation and capacitation. Endocrinology, 2010. 151(3): p. 1269-79. 69. Aitken, R.J., et al., Oxidative stress and male reproductive health. Asian J Androl, 2014. 16(1): p. 31-8. 70. Aitken, R.J., et al., The Simmet lecture: new horizons on an old landscape--oxidative stress, DNA damage and apoptosis in the male germ line. Reprod Domest Anim, 2012. 47 Suppl 4: p. 7-14. 71. Koppers, A.J., et al., Phosphoinositide 3-kinase signalling pathway involvement in a truncated apoptotic cascade associated with motility loss and oxidative DNA damage in human spermatozoa. Biochem J, 2011. 436(3): p. 687-98.