Aislamiento y caracterización de una isoforma de caseina quinasa tipo I en Dyctyostelium discoideum

Zusammenfassung

En esta tesis se ha llevado a cabo la clonación y caracterización de una isoforma de caseina quinasa tipo I en Dictyostelium discoideum (DdCKI). La secuencia de aminoácidos deducida presenta un 70% de homología en el dominio catalítico con el de las isoformas de mamífero CKId y CKIe y un 68% de identidad con la sisoforma de levadura Hrr25, implicada en reparación de DNA. El mensajero de DdCKI se expresa de forma constitutiva durante todo el ciclo vital de Dictyostelium. El anticuerpo generado reconoce una banda de masa molecular 49 kDa, tamaño similar al deducido a partir de la secuencia, los niveles de proteína no varían significativamente a lo largo del ciclo vital de este organismo, al igual que la expresión del gen. Cuando se analiza la expresión de DdXKI en bacterias se obtiene una enzima activa que se autofosforila y fosforila caseína, además se detecta una regulación por heparina y polilisina. Ensayos de inmunofluorescencia muestran que DdCKI se localiza tanto en el citosol como en el nucleode células de Dictyostelim. No hemos podido obtener cepas mutantes que presenten el gen de DdCKI alterado, lo que sugiere que esta porteína es esencial para el crecimiento vegatativo de este organismo. La sobre-expresión de DdCKI general células resistentes al tratamiento con Hidroxiurea, no así con cisplatino. Aunque estas células no tienen alteraciones fenotípicas aparentes durante la diferenciación, la sobre-expresión de la proteína provoca un enlentecimiento de los procesos mitóticos..