Generación de un sistema lentiviral para la expresión de prolactinas recombinantes y su uso para la transducción de células hepáticas

Resumen

La participación de la prolactina (PRL) en más de 300 procesos biológicos ha conllevado a que se considere a esta molécula como una hormona pleiotrópica que actúa en diversos procesos fisiológicos y patológicos. No obstante, la propia naturaleza de la PRL y el limitado número de herramientas biotecnológicas de las que se dispone para el estudio de su función, hacen complicado delimitar su contribución en muchos de estos procesos. Por lo tanto, es necesario la generación de nuevas herramientas que permitan modular la acción de la PRL y ayuden a esclarecer su participación en varios de estos escenarios biológicos, entre los que destaca la homeostasis hepática. El objetivo de este trabajo de investigación fue generar un sistema lentiviral que permitiera la modulación de la acción de la PRL y fuera útil para el estudio de su función en diferentes procesos biológicos. Así, clonamos la secuencia codificante de la PRL humana (hPRL), generamos dos de sus mutantes antagonistas y expresamos estas hormonas recombinantes en células eucariotas. Tras comprobar su correcta expresión y respectivas bioactividades, transferimos estas secuencias a vectores lentivirales (LVs) para co-expresarlas junto con la proteína verde fluorescente (GFP) a partir de un único transcrito gracias a la secuencia P2A (hPRL-P2A-GFP). Nuestros resultados mostraron que estos LVs fueron capaces de transducir y expresar de forma eficiente las hPRL recombinantes en distintos tipos celulares. Las hPRL fusionadas al P2A se secuenciaron mediante espectrometría de masas y se comprobó la bioactividad de cada una de ellas en experimentos in vitro. La expresión de los transgenes hPRL-P2A-GFP permitió identificar tanto a las células productoras de hormonas (células GFP positivas), como a las hormonas recombinantes que contienen el epítopo P2A. Además, estas proteínas recombinantes secretadas por las células transducidas fueron capaces de reproducir las acciones autocrinas y paracrinas esperables en cultivos celulares. Tras la caracterización del sistema lentiviral, nuestro siguiente objetivo fue evaluar su capacidad para transducir diferentes líneas celulares establecidas de origen hepático y hepatocitos primarios humanos ex vivo. Nuestros resultados demostraron que los hepatocitos transducidos con nuestro sistema lentiviral expresaban y procesaban correctamente las construcciones hPRL-P2A-GFP in vitro. En resumen, el sistema lentiviral descrito en este trabajo muestra unas características apropiadas para el estudio de las acciones de hPRL en diferentes procesos biológicos, siendo particularmente útil para el estudio de las acciones de la PRL en la homeostasis hepática.