Producción de isobutanol a partir de glucosa en cultivos de "Shimwellia blattae" (p424IbPSO)desarrollo, fenomenología y modelización

Zusammenfassung

El incremento reciente en la demanda de combustibles fósiles ha provocado una creciente preocupación por el agotamiento de estas fuentes no renovables y por el impacto ambiental que conlleva su uso. Numerosos estudios se han centrado en la obtención de sustitutos del bioetanol como combustible, tales como el isobutanol, compuesto que presenta algunas características que lo hacen atractivo, ya que además de como carburante puede ser empleado como platform chemical. El bio-proceso de producción de isobutanol es un proceso reciente, la mayoría de los estudios se han centrado en la construcción de diferentes cepas de microorganismos (GMO) productores. El principal objetivo de este trabajo es la optimización del proceso de producción de isobutanol con S. blattae (p424IbPSO), empleando glucosa como modelo de hidrolizado de paja de trigo. Para ello, se han probado dos tipos de operación: con células en estado de crecimiento; y con células en estado de resting cells. Otros objetivos fundamentales son la determinación de un modelo cinético del proceso y el estudio de la fenomenología: el papel que juega el transporte de oxígeno y el posible estrés hidrodinámico. Para la optimización del proceso con células en crecimiento, se ha determinado la composición del medio de cultivo óptima y, después, las mejores condiciones de operación. Se ha establecido que la concentración inicial de sustrato óptima es 45 g.L-1, observando que con concentraciones superiores a 50 g.L-1 se inhibe la producción de isobutanol. Empleando estas condiciones se han obtenido 11 g.L-1 de isobutanol. Se ha formulado un modelo cinético capaz de describir la evolución de los componentes clave. También se ha llevado a cabo un estudio sobre la influencia del oxígeno en el citado proceso. La producción de isobutanol en condiciones aeróbicas es baja, ya que el flujo de carbono se desvía hacia la producción de otros compuestos no descritos previamente, y se ha llevado a cabo la identificación de los mismos, estableciendo un esquema metabólico que depende de la disponibilidad de oxígeno. Se ha probado la producción con células en estado de resting cells, demostrando la capacidad de producción de la cepa en dicho estado; se han optimizado las condiciones de la etapa de obtención de biomasa. Se ha profundizado en este estudio a escala de tanque agitado, comprobando el efecto de las condiciones fluido-dinámicas. Los resultados muestran que la velocidad de crecimiento aumenta hasta una velocidad de agitación de 600 rpm. se mantiene constante hasta 1000 rpm y disminuye en los experimentos con agitación superior a 1200 rpm. Se ha comprobado que la viabilidad y la integridad celular disminuyen a partir de 800 rpm, debido a las velocidades de cizalla, que generan estrés hidrodinámico. Por otro lado, los cambios en OTR y OUR modifican la distribución de los metabolitos producidos, tanto en experimentos con células en crecimiento como en resting cells. Se determinó que la agitación óptima para la obtención de biomasa es 400 rpm. Se ha observado que las células producidas bajo diferentes condiciones fluido-dinámicas tienen una distribución de metabolitos diferente en las pruebas de resting, aun cuando dichas pruebas son realizadas de forma similar. En este trabajo se evidencia la importancia del oxígeno como nutriente, y la importancia del estudio de las condiciones fluido-dinámicas en los procesos aeróbicos, tales como la producción de isobutanol. Finalmente, se ha procedido a la construcción genética de diferentes cepas con el fin de mejorar la capacidad de producción de isobutanol en anaerobiosis. Primero, insertando un gen que codifica para una alcohol-deshidrogenasa no dependiente de NADPH, que mejora la producción de isobutanol, siendo esta producción mejor cuando se inserta una enzima transhidrogenasa, que mantiene un equilibrio entre las concentraciones de NADH y NADPH. Con este trabajo se ha puesto de manifiesto la importancia de la ingeniería de cofactores en este proceso.