New optical biosensing strategies for the analysis of mycotoxins and toxigenic fungi in food

Laburpena

Las micotoxinas son metabolitos secundarios tóxicos producidos por algunas cepas de hongos que contaminan alimentos. Estos compuestos de bajo peso molecular son químicamente y toxigénicamente heterogéneos; sin embargo, muchas de estas toxinas pueden originar enfermedades, y en ocasiones la muerte, tanto en humanos como en otros vertebrados. Los hongos toxigénicos crecen en condiciones muy diversas, lo que favorece la aparición de micotoxinas en una gran variedad de alimentos. Actualmente, no existen alternativas viables para su eliminación en los productos agrícolas y se requieren métodos analíticos sensibles y selectivos para la detección de micotoxinas y hongos toxigénicos, a bajas concentraciones, a fin de garantizar la seguridad alimentaria. Los biosensores son dispositivos que permiten la realización de análisis rápidos, sensibles y selectivos empleando instrumentos compactos y de bajo coste. Dadas sus indudables ventajas, estos dispositivos permiten evitar algunas de las limitaciones de los métodos analíticos convencionales, de forma que su empleo para el control de la seguridad alimentaria se ha incrementado notablemente en los últimos años. El objetivo principal de esta tesis doctoral ha sido el desarrollo de nuevos biosensores para el análisis de micotoxinas y hongos toxigénicos en alimentos. Con este fin, se han diseñado o seleccionado nuevos elementos de reconocimiento para llevar a cabo la detección sensible, selectiva, rápida y a bajo coste de estos contaminantes usando diferentes estrategias y formatos de ensayo. Entre los hongos toxigénicos, el género Fusarium es uno de los más comunes y ampliamente extendidos a nivel mundial. En la primera parte de esta tesis, se diseñaron sondas de ADN específicas para la identificación de F. proliferatum y F. verticillioides. Para el desarrollo del genosensor se diseñaron sondas de captura y detección, que permitieron su identificación inequívoca, a concentraciones picomolares, en muestras de maíz contaminadas naturalmente con dichos hongos, empleando detección enzimática. Para ello el ADN genómico se amplificó mediante PCR utilizando un par de cebadores comunes. Los resultados obtenidos demuestran la selectividad de los biosensores desarrollados para los hongos, y constituyen una valiosa herramienta para evaluar la contaminación de alimentos con hongos toxigénicos. En la segunda y principal parte de la tesis se han desarrollado inmunoensayos y biosensores ópticos para el análisis de micotoxinas. Concretamente, se han analizado fumonisina B1, toxina T-2 y zearalenona utilizando mimopéptidos que imitan el epítopo característico de un antígeno, uniéndose al mismo parátopo que éstos en el correspondiente anticuerpo selectivo. Para seleccionar los mimopéptidos se ha aplicado la técnica de despliegue de péptidos sobre la superficie de fagos (¿phage display¿). Los dispositivos desarrollados emplean, alternativamente, los fagos que despliegan el mimopéptido de interés o el mimopéptido obtenido sintéticamente. Los péptidos sintéticos se han utilizado para el desarrollo de ¿microarrays¿ e inmunoensayos basados en el empleo de partículas magnéticas. Se han alcanzado límites de detección muy inferiores a los límites máximos de residuos establecidos por la Unión Europea. Por otra parte, se han diseñado y producido proteínas de fusión recombinantes compuestas por los mimopéptidos de las micotoxinas estudiadas y una proteína fluorescente o bioluminiscente. Las proteínas recombinantes se han aplicado al desarrollo de ensayos de tipo heterogéneo, empleando proteínas de fusión del mimopéptido con el anticuerpo selectivo inmovilizado, y de tipo homogéneo, utilizando nanopartículas de oro y medidas de desactivación de la fluorescencia. Este ensayo se realiza en una única etapa, sin la necesidad de lavados, reduciéndose el tiempo de análisis. La simplicidad y excelentes características analíticas de los métodos desarrollados son de gran utilidad para la determinación de micotoxinas en alimentos.