Resurrection of ancestral ligninolytic peroxidases

Resumen

La lignina es uno de los biomateriales más abundantes sobre la Tierra, y su degradación es un tema importante tanto a nivel biológico como a nivel industrial. En la naturaleza, el reciclado de la lignina es esencial en el ciclo del carbono, siendo los hongos de la podredumbre blanca los principales organismos capaces de mineralizar este polímero. A nivel industrial, el uso de dichos hongos o de su maquinaria enzimática se estudia para un mejor aprovechamiento de la lignocelulosa en la industria de la biorrefinería. Para la degradación de la lignina los hongos de la podredumbre blanca secretan diversos tipos de peroxidasas de clase II, clasificadas en base a sus distintos sitios de oxidación en manganeso peroxidasas (MnPs), lignina peroxidasas (LiPs) y peroxidasas versátiles (VPs). El origen de la degradación fúngica de la madera se estableció en el Carbonífero asociado a la producción de las primeras peroxidasas ligninolíticas y ese es el punto de partida de esta tesis, donde se analiza la posterior evolución de las peroxidasas ligninolíticas. Usando el software PAML y la filogenia de las peroxidasas de clase II de los Polyporales (donde se incluyen la mayoría de hongos de la podredumbre blanca) se obtuvieron los ancestros en el linaje que conduce a las enzimas ligninolíticas más eficientes que existen actualmente, las LiPs, que poseen un triptófano expuesto en su superficie para oxidar el voluminoso polímero de lignina. Mediante el uso de sustratos modelo simples, se caracterizaron los distintos sitios de oxidación de las enzimas y se comprobó cómo exploraron nuevas estrategias para la oxidación de lignina a lo largo de la evolución. Así mismo, se vio que dicha exploración hacia estrategias más eficientes es un rasgo convergente en Polyporales, demostrado con la resurrección de una segunda línea evolutiva que lleva hasta las VPs actuales. Además se produjo de forma convergente en ambas líneas evolutivas una estabilización a pHs ácidos, donde estas enzimas actúan en la naturaleza y donde su potencial redox es mayor. El linaje de peroxidasas ancestrales que conduce a las LiPs actuales también permitió analizar cómo las peroxidasas ligninolítcas adquirieron a lo largo de la evolución el alto potencial redox que las caracteriza y que les permite oxidar sustratos tan recalcitrantes como la lignina. Para ello se optimizaron distintas técnicas para calcular el potencial de reducción, obteniéndose los valores de potencial redox de todas las parejas del ciclo catalítico de las peroxidasas y del par Fe(II) Fe(III). Los resultados muestran que se produjo un aumento generalizado del potencial redox en las peroxidasas ligninolíticas a lo largo de la evolución, un hecho que se ha podido correlacionar con cambios estructurales en el entorno del grupo hemo. Dicho cambio estructural fue observado con el desplazamiento de la señal correspondiente a la histidina proximal, coordinada con el hierro del hemo, usando NMR de proteínas. Por último, se caracterizó el linaje de las LiPs usando dos tipos de lignina soluble en agua: lignosulfonatos de gimnospermas y de angiospermas. Mediante espectrofotometría de stopped-flow se obtuvieron las constantes de estado transitorio para la oxidación de lignina, y usando 2D NMR se analizó cómo se modifica el polímero a lo largo de la evolución en base a tratamientos prolongados de ambos lignosulfonatos con enzimas actuales y resucitadas. Tras la calibración temporal de la filogenia de las peroxidasas, se ha podido concluir que hubo un cambio en la preferencia de sustrato cuando apareció el triptófano catalítico en la superficie de las peroxidasas ligninolíticas. De este modo, se pasó de una mejor oxidación de lignina de gimnospermas, más basal, a una preferencia por la lignina de angiospermas, más reciente y compleja, coincidiendo con el origen y diversificación inicial de este tipo de plantas en la evolución.