Modelos celulares de inmunodeficiencias congénitas de linfocitos taplicación a estudios de expresión y señalización

  1. Briones Contreras, Alejandro
Supervised by:
  1. Paula Patricia Cardenas Mastrascusa Director
  2. José Ramón Regueiro González-Barros Director

Defence university: Universidad Complutense de Madrid

Fecha de defensa: 26 November 2019

Committee:
  1. Pedro Roda Navarro Chair
  2. Luis M. Allende Martínez Secretary
  3. Rebeca Rodríguez Pena Committee member
  4. Hisse Martien van Santen Committee member
  5. José María Rojo Hernández Committee member
Department:
  1. Inmunología, Oftalmología y ORL

Type: Thesis

Abstract

Los linfocitos T inician la respuesta inmunitaria adaptativa a través de su receptor, el TCR, que desencadena una red de señalización para generar respuestas efectoras adecuadas. El TCR es un complejo octamérico constituido por diferentes cadenas entre las que se encuentra CD247. La ausencia de cualquiera de estos componentes se traduce en un defecto de los linfocitos T causante de SCID. Además, en los casos de deficiencias de CD247 se han descrito mutaciones somáticas capaces de restaurar el defecto de expresión del TCR.Dentro de las rutas de señalización del TCR, se encuentra el complejo CBM (CARD11-BCL10-MALT1). Mutaciones en cualquiera de estos 3 genes se han reportado como causantes de SCID.ObjetivosEl objetivo principal de este trabajo es diseñar modelos celulares de inmunodeficiencias humanas originadas por la deficiencia de CD247 y de BCL10.Para ello, en la deficiencia de CD247 el objetivo es desarrollar un sistema para evaluar el impacto de las mutaciones en esta cadena sobre la expresión del TCR.En cuanto a BCL10, el objetivo es estudiar su papel en linfocitos T mediante líneas deficientes y heterocigotas y, además, dilucidar si la heterocigosis de BCL10 se puede catalogar como haploinsuficiencia.Resultados y discusiónUtilizamos una línea humana CD247 deficiente, PM1T, para hacer ensayos de reconstitución del TCR, por transfección de diferentes variantes de CD247. La línea PM1T transfectada con CD247 WT reconstituyó peor el TCR que su línea homóloga de ratón, MA5.8; similarmente, la mutación germinal Q70X, no restauró el TCR en PM1T, pero sí en MA5.8. De las reversiones somáticas Q70L, Q70W y Q70Y, la variante Q70Y reconstituyó peor que las otras. Debido a las dificultades para transfectar PM1T, estos experimentos también se realizaron por transducción retroviral, mejorando la eficiencia de restauración del TCR.Finalmente, se generó una línea Jurkat deficiente para CD247, (ZKO), que recuperó completamente la expresión del TCR con la proteína WT, y en menor medida con las reversiones somáticas, siendo más baja en Q70Y. La transfección en ZKO y su control nos permitió evaluar el efecto dominante negativo generado por la mutación Q70X. Al estudiar la nueva mutación, Q101X, el efecto dominante negativo se repetía.A partir de una línea T (HTLV-I) BCL10 deficiente, pudimos comprobar que las respuestas a la estimulación del TCR estaban afectadas. ICOS, CD25 e IRF4 no eran inducibles vía TCR. La producción de IFN¿, IL-2 y TNF¿ estaba reducida, lo que sugiere que el complejo CBM, si bien induce su producción, no lo hace en exclusiva.Generamos dos líneas Jurkat: una deficiente y otra heterocigota para BCL10.. Estas líneas confirmaron los datos obtenidos en las células HTLV-I. La producción de IL-2 estaba completamente impedida en la línea deficiente y la inducción de CD25 estaba parcialmente afectada. También vimos que la degradación de Reg-1, debida a la actividad proteolítica del complejo CBM, también se encontraba afectada. Curiosamente, en la línea heterocigota se observó un fenotipo idéntico a la línea deficiente. ConclusionesAl reproducir la línea ZKO la condición hallada en el paciente en el que se describió la mutación Q70X, cosa que no hacía el modelo anterior, consideramos más adecuado su uso como modelo. Con nuestros datos podemos concluir que la región intracelular de CD247 es indispensable para la expresión del TCR, hallándose un efecto dominante negativo en aquellas mutaciones que acorten esa región. Las mutaciones somáticas descritas pueden revertir el defecto T, pero no todas por igual.En cuanto a BCL10, nuestros experimentos han mostrado como la ausencia de esta proteína es crítica para gran parte de las respuestas efectoras del linfocito T. Las líneas heterocigotas en BCL10 han permitido determinar que la reducción de los niveles de BCL10 genera un defecto similar al de la línea deficiente, lo que plantearía catalogar este defecto como autosómica dominante y considerarla una haploinsuficiencia.