Aspectos estructurales de peroxidasas de tipo DYP de "Auricularia auricula-judae" y de "Pleurotus ostreatus"

Resumen

Las hemo peroxidasas catalizan óxido-reducción de gran variedad de sustratos en presencia de peróxido de hidrógeno. Las peroxidasas de tipo DyP o decolorantes de tinte (dye-decolorizing peroxidases) son hemo peroxidasas presentes en bacterias, arqueas, protistas y hongos, con gran diversidad de secuencia. Se caracterizan por su gran estabilidad en condiciones extremas de pH, temperatura y presión. Oxidan multitud de sustratos como compuestos modelo de lignina o tintes antraquinónicos y azoicos. Estas características podrían aplicarse en procesos como la biorremediación, la producción de biocombustibles, el tratamiento de materias primas o la síntesis orgánica de compuestos. Junto al grupo de Biotecnología para la Biomasa Lignocelulósica del CIB (CSIC), se han resuelto las estructuras de dos DyP de hongos basidiomicetos: DyP1 de Auricularia auricula-judae y DyP4 de Pleurotus ostreatus. En estudios previos de AauDyP1 se obtuvieron las estructuras de la enzima nativa y de varios mutantes que, junto a los ensayos de actividad enzimática, permitieron determinar la ruta de transferencia electrónica desde la superficie hasta el grupo hemo. Decidimos diseñar mutaciones que afectaran al canal de acceso al grupo hemo para mejorar el acceso de sustratos poco voluminosos. Para ello, se diseñaron dos mutantes L357G y F359G. La enzima nativa y sus mutantes se clonaron en pET23a, se expresaron en E. coli y se purificaron, previo replegado in vitro, por cromatografía de intercambio iónico. Se obtuvieron cristales de calidad suficiente para recoger los datos de difracción empleando radiación sincrotrón. Las estructuras se resolvieron mediante reemplazo molecular. Éstas conservan la topología característica de las DyPs, con dos dominios formados por hélices alfa y láminas beta antiparalelas formando un barril beta. Los cambios producidos por las mutaciones amplían el bolsillo hemo en el mutante F359G, mientras en L357G aumenta el diámetro del canal de acceso a la cavidad. Estos resultados, junto con los ensayos de actividad enzimática y las simulaciones computacionales, indican que la capacidad de sulfoxidación de los mutantes se produce por el acceso del sustrato al cofactor hemo, con energías de interacción más favorables. Además, el análisis de los productos de la sulfoxidación muestra la alta estereoselectividad del mutante F359G, con hasta un 99% de exceso del enantiómero S. La peroxidasa DyP4 de P. ostreatus cataliza la oxidación de Mn(II) a Mn(III), en presencia de peróxido de hidrógeno, con una eficiencia similar a la descrita en peroxidasas de manganeso y peroxidasas versátiles de hongos de podredumbre blanca. Como no se disponía de ningún modelo estructural, con el objetivo de identificar la ruta de transferencia electrónica implicada en la oxidación del Mn(II) se abordó la resolución de la estructura tridimensional de PleosDyP4 nativa, y se diseñó una batería de mutantes basados en la información estructural de peroxidasas con esta actividad enzimática. Las mutaciones afectan a residuos aromáticos y residuos ácidos: E190A, F194W, F194Y, D196A, D215A, Y339A, E345A, D352A, D354A, D352A/D354A y E354A/D352A/D354A. Estos mutantes y la enzima nativa se clonaron en pET15b (añade una cola de histidinas en el extremo N-terminal) se expresaron en E. coli y se purificaron mediante cromatografía de afinidad. Se obtuvieron cristales de la proteína nativa PleosDyP4 y de los mutantes: E190A, F194W, F194Y y D196A; y se recogieron los datos de difracción de rayos-X. Las estructuras se resolvieron por reemplazamiento molecular. Estas presentan dos dominios formados por hélices alfa y láminas beta antiparalelas, con un plegamiento tipo ferredoxina. Ensayos de cocristalización con MnCl2 han permitido identificar su sitio de unión en la superficie enzimática. Los resultados obtenidos en los ensayos de actividad y simulaciones computacionales confirman la importancia del E345 y la Y339 en la transferencia de electrones inicial del Mn(II)