Aplicaciones de la proteómica en la alergiaidentificación y caracterización de alérgenos de relevancia clínica en la cuenca mediterránea

Zusammenfassung

La alergia respiratoria afecta a un 25-30% de la población, constituyendo una de las principales causas de hipersensibilidad tipo I. Existen gran variedad de pólenes implicados en el desarrollo de la respuesta alérgica. La expansión de la desertificación ha provocado un aumento de la presencia de plantas adaptadas a condiciones extremas de salinidad y sequía que ha provocado que la sensibilización a su polen haya aumentado. Salsola kali es un importante agente inductor de la alergia en la Península Ibérica. Además, el polen del olivo actúa como principal inductor de alergia en Andalucía dado su intenso cultivo. El conocimiento de las moléculas responsables de desencadenar la alergia permite un diagnóstico más preciso y mejorar el tratamiento de los pacientes. La combinación de estrategias convencionales y emergentes resulta imprescindible para el estudio de las proteínas alergénicas. Entre ellas destaca la proteómica, que permite el análisis a gran escala y en profundidad de las proteínas. Esta Tesis Doctoral se ha centrado en el estudio de aeroalérgenos presentes en salsola y olivo, utilizando distintos enfoques proteómicos. Además, se ha analizado el papel de Ole e 7 en la interacción con lípidos, así como en procesos de sensibilización y de reactividad cruzada con Pru p 3. Por un lado, se caracterizó estructural e inmunológicamente una poligalacturonasa alergénica del polen de Salsola kali ¿Sal k 6¿. Mediante LC-MS/MS confirmamos la coexistencia de una banda de 28 kDa junto con la proteína alergénica íntegra de 47 kDa, tratándose de un producto de degradación natural. Además, confirmamos que Sal k 6 presentaba reactividad cruzada con proteínas de la familia Oleaceae, incluido el polen de olivo (Olea europaea). Por ello, se abordó la identificación de poligalacturonasas en dicho polen, demostrando la existencia de una poligalacturonasa hipoalergénica, Ole e 14, tras lo cual se analizaron sus características estructurales e inmunológicas, confirmando la existencia de epítopos comunes entre Ole e 14 y Sal k 6. Por otro lado, mediante LC-MS/MS, se obtuvo por secuenciación de novo la secuencia primaria completa del alérgeno del polen de olivo Ole e 7. Tras su producción recombinante en Pichia pastoris, se analizaron sus características estructurales e inmunológicas, confirmando que conservaba las propiedades del alérgeno natural. Por otro lado, se ha determinado que Ole e 7 interacciona con una amplia gama de lípidos, mostrando cierta especificidad por el ácido oleico. Sin embargo, en ninguno de los casos se detectaron cambios significativos en sus características estructurales y alergénicas. Asimismo, se confirmó la capacidad de adsorción del alérgeno a la interfase aire-líquido, utilizando modelos de monocapas de fosfolípidos y surfactante pulmonar. Se estudió también la relación entre Ole e 7 y Pru p 3, alérgeno principal del melocotón involucrado en reacciones cruzadas con otras nsLTPs y sensibilizador primario en la alergia a otras nsLTPs, en poblaciones con elevada exposición al polen de olivo. Se identificaron epítopos comunes a ambos alérgenos y, además, los ensayos ex vivo e in vitro revelaron una respuesta frente a Pru p 3 en pacientes sensibilizados únicamente a Ole e 7, sugiriendo un nuevo papel de Ole e 7 como sensibilizador primario de la alergia al melocotón a través de nsLTPs. Por último, planteamos una nueva metodología para el análisis epitópico de alérgenos mediante microarrays Halo Tag-NAPPA. Este método sería adecuado para detectar alérgenos implicados en reacciones cruzadas e identificar potenciales epítopos IgE. En esta Tesis Doctoral se han utilizado distintos enfoques proteómicos que han permitido la identificación y caracterización de nuevos alérgenos relevantes desde el punto de vista clínico, y la obtención de la estructura primaria de Ole e 7, uno de los principales alérgenos en Andalucía, permitiendo su caracterización estructural, funcional e inmunológica.