Derivados de bis(benzimidazol) como nuevo vector para el estudio de la interacción de carbohidratos con el surco menor del ADN

  1. García Puentes, Diego
Dirigée par:
  1. Cristina Vicent Laso Directeur/trice

Université de défendre: Universidad Complutense de Madrid

Fecha de defensa: 29 octobre 2019

Jury:
  1. Miguel Ángel Sierra Rodríguez President
  2. María Angeles Canales Mayordomo Secrétaire
  3. Marco Eugenio Vázquez Sentís Rapporteur
  4. Juan Carlos Morales Sánchez Rapporteur
  5. Jesús Jiménez Barbero Rapporteur

Type: Thèses

Résumé

El objetivo general de la tesis es cuantificar la contribución a la interacción de los carbohidratos con el interior del surco menor del ADN. Para ello, el primer objetivo ha sido el diseño de un nuevo tipo de vector que acerque al carbohidrato hasta el surco menor del ADN. En este contexto, los ligandos de la familia Hoechst se ajustan a nuestro objetivo debido a que su interacción con el surco menor del ADN es bien conocida y presentan una elevada afinidad por secuencias AT. Además, se ha descrito en la literatura un análogo de Hoechst con un grupo ácido en un extremo, lo que posibilita la formación de enlaces amida. Dicha estructura se ha empleado para el diseño de nuestros ligandos glicosilados y un derivado de ciclohexilo. Para el estudio de la interacción de los ligandos con oligonucleótidos de ADN, se han seleccionado las secuencias CGCGAATTCGCG y CGCAAATTTGCG (A2T2 y A3T3) y se han realizado valoraciones por dicroísmo circular de todos los ligandos con ambas secuencias. Estos estudios muestran un incremento del dicroísmo circular molar muy elevado, indicando que los ligandos se introducen en el interior del surco menor del ADN. Para corroborar este hecho, se realizaron experimentos de STD entre estos ligandos y un polímero de ADN. La transferencia de saturación al carbohidrato es elevada, indicando que se ha alcanzado el objetivo buscado. El hecho de que el carbohidrato llegue hasta el interior del surco menor le permite establecer su interacción con los centros dadores y aceptores de enlace de hidrógeno de las bases del ADN. Así, los distintos carbohidratos interaccionarían de distinto modo con una misma secuencia de ADN. A través de los experimentos de valoración por CD, se ha logrado cuantificar por primera vez la contribución del carbohidrato a la interacción con el surco menor del ADN. El derivado que presenta una menor afinidad es el de ciclohexilo, indicando por comparación que el carbohidrato presenta una contribución favorable a la interacción con el ADN, llegando a las 2.0 Kcal/mol de diferencia en el caso más favorable (L-Glc). El efecto de la quiralidad del carbohidrato también ha sido cuantificado: los derivados de carbohidratos de la serie L presentan una mayor afinidad que sus homólogos de la serie D, llegando a las 0.9 Kcal/mol de diferencia. Se ha comparado la interacción de los derivados de D-Man y D-Glc con ambos oligonucleótidos. Para la secuencia A2T2, la afinidad de D-Man es mayor que la de D-Glc en 0.3 Kcal/mol, lo que podría suponer un aporte de la cooperatividad de enlace de hidrógeno a la estabilidad del complejo. Con el objetivo de conocer el sitio de unión de los ligandos, es necesario realizar un estudio estructural de los complejos formados, centrándonos en el carbohidrato. Así se podrán determinar los centros específicos con los que interaccionan o si interviene la cooperatividad de enlace de hidrógeno en la interacción de los derivados de Manosa. Por ello, se sintetizó el ligando derivado de D-Man con el carbohidrato uniformemente marcado con 13C y se realizó la elucidación estructural por RMN del complejo con A2T2 mediante experimentos bidimensionales y tridimensionales. Se observaron nOes entre el carbohidrato y el protón H1¿ de la desoxirribosa A5 del oligonucleótido, confirmando su proximidad al interior del surco y localizando su sitio de interacción. Se pudo determinar que los centros 1 y 2 de la Manosa (involucrados en el enlace de hidrógeno intramolecular) están orientados hacia el interior del surco menor y están próximos a la Adenina A5-A (que cuenta con aceptores de enlace de hidrógeno). Teniendo en cuenta esta información estructural y los datos de estabilidad obtenidos por CD para los dos complejos¿¿D-Glc y D-Man), es muy posible que la contribución extra de 0.3 Kcal/mol a la estabilización del complejo con A2T2 en favor de la manosa se deba a la presencia de un enlace de hidrógeno cooperativo entre el hidroxilo 2 de la Manosa y la adenina A5-A.