Modelos in vitro de la infección por "Besnoitia besnoiti" y su empleo en estudios de patogenia molecular y cribado de fármacos

Resumen

La besnoitiosis bovina es una enfermedad de curso crónico y debilitante ocasionada por el protozoo apicomplejo Besnoitia besnoiti. Esta enfermedad ocasiona considerables pérdidas económicas y no hay tratamientos o vacunas eficaces disponibles. Por ello, el desarrollo de modelos in vitro es clave para estudiar la interacción patógeno hospedador y para identificar posibles candidatos terapéuticos y vacunales. El objetivo de esta tesis doctoral fue el desarrollo y la estandarización de nuevos modelos in vitro de infección por B. besnoiti y su posterior empleo en estudios de patogenia molecular y cribado de fármacos. En el objetivo 1 se han desarrollado nuevos modelos in vitro mediante el aislamiento de cultivos primarios bovinos, células endoteliales BAEC y fibroblastos, que representan células diana del parásito durante la fase aguda y crónica de la enfermedad, respectivamente. Mediante citometría de flujo, se caracterizó el perfil de expresión de una serie de marcadores de superficie e intracelulares y se estudió el ciclo lítico de los taquizoítos de B. besnoiti, siendo éste muy similar al previamente descrito en las células inmortalizadas Marc145. Además, se ha comprobado que el virus de la diarrea vírica bovina favorece la invasión temprana de las células hospedadoras por parte del parásito. Posteriormente, en el objetivo 2, se han empleado los modelos in vitro en estudios de patogenia molecular y cribado de fármacos. En primer lugar, se ha estudiado la interacción parásito-célula hospedadora en células BAEC a dos tiempos post-infección, a las 12 hpi y a las 32 hpi mediante RNASeq. Los resultados obtenidos muestran que la infección por B. besnoiti produce una activación de las BAEC con la sobreexpresión de genes que codifican diversas citoquinas, IL6, IL1A, quimioquinas CCL2, CCL24, CXCL1, CXCL2, CXCL3, moléculas de adhesión SELE, ICAM1, VCAM1, moléculas implicadas en la angiogénesis, como factores de crecimiento e integrinas, y en la organización de la matriz extracelular, como metaloproteasas y ADAMTS. Las principales rutas de señalización moduladas fueron la ruta del factor de transcripción nuclear NFKB y la ruta proinflamatoria del TNF alfa, que desencadenarían un proceso de inflamación y fibrosis compatible con las lesiones histológicas descritas in vivo. También se estudió el transcriptoma de los taquizoítos de B. besnoiti a ambos tiempos, identificándose por primera vez genes que codifican proteínas implicadas en su ciclo lítico: proteínas de gránulos densos GRA, proteínas de roptrias RON y ROP, proteínas de micronemas MIC, y de superficie SRS, entre otras. Posteriormente, se ha evaluado la seguridad y eficacia de diferentes fármacos, tanto ya comercializados en la especie bovina, como decoquinato, diclazurilo, toltrazurilo, imidocarb, sulfadiazina y trimetoprim, sólo o en combinación con sulfadiazina, como de nueva generación o bumped kinase inhibitors, BKIs, en células Marc145. Los resultados han mostrado que ninguno de los compuestos analizados mostraba citotoxicidad. De los fármacos ya comercializados, en el subobjetivo 2.2, el diclazurilo y el decoquinato mostraron los mejores resultados en el cribado inicial, inhibiendo la invasión y proliferación del parásito. Además, se demostró que el decoquinato actuaba en la mitocondria de los parásitos, mientras que el diclazurilo interfería en la citoquinesis. Por otra parte, en el subobjetivo 2.3., se ha identificado y clonado el gen que codifica para la enzima BbCDPK1, diana de los BKIs, y se ha comprobado su inhibición con un panel de nueve BKIs. Los compuestos 1294, 1517, 1553 y 1571 mostraron los mejores resultados de eficacia en el cribado inicial, pero dichos tratamientos no fueron parasiticidas y se confirmó que los BKIs interferían en la citoquinesis. En resumen, el decoquinato, el diclazurilo y los BKIs son herramientas terapéuticas prometedoras si bien son necesarios futuros ensayos de seguridad y eficacia en el ganado bovino.