Caracterización estructural y funcional del complejo mTORC2

Resumen

mTOR es una serina/treonina quinasa que constituye la subunidad catalítica de dos complejos diferentes tanto a nivel funcional como estructural: mTORC1 y mTORC2 (Brown et al. 1994; Sabatini et al. 1994; Sabers et al. 1995). El complejo mTORC1 además de la subunidad mTOR, está formado por las proteínas principales mLST8 y Raptor (Kim et al. 2002; Kim et al. 2003). El complejo mTORC1 también contiene dos subunidades inhibitorias: las proteínas Deptor (del inglés, DEP y PRAS40 (Sancak et al. 2007; Panic et al. 2016). Entre las principales funciones del complejo mTORC1 se encuentra la síntesis de proteínas, lípidos y nucleótidos, así como la inhibición de rutas catabólicas como la autofagia (Gingras, Raught, and Sonenberg 2001; Bakan and Laplante 2012; Ben-Sahra et al. 2016; Kim et al. 2011). El complejo mTORC2, además de mTOR, presenta las subunidades proteicas mLST8, Rictor, mSIN1, Deptor y Protor (Cheng et al. 2015; Pearce et al. 2007; Thedieck et al. 2007). mTORC2 controla la proliferación y supervivencia celular mediante la fosforilación y activación de las proteínas Akt, PKC y SGK1. Entre las funciones del complejo mTORC2 se encuentra la regulación de la apoptosis, la reorganización del citoesqueleto así como de la síntesis de proteínas dependiente del complejo mTORC1 (Saxton and Sabatini 2017). Mientras que mTORC1 ha sido ampliamente estudiado; sobre el complejo mTORC2 aún quedan muchas incógnitas por resolver en cuanto a su papel funcional, y hasta hace relativamente poco su estructura no era conocida. Dada la importancia clínica del complejo mTORC2, conocer la estructura del mismo serviría como pilar para el diseño de inhibidores específicos del complejo mTORC2 (Jhanwar-Uniyal et al. 2013). Sin embargo, el gran peso molecular del complejo mTORC2 dificulta la purificación y la obtención de una muestra homogénea e íntegra que pueda ser caracterizada funcional y estructuralmente. Considerando estos antecedentes, el presente trabajo de investigación está basado en el estudio funcional y estructural del complejo mTORC2. Para ello, se llevó a cabo la optimización de la purificación del complejo mTORC2 a partir de la sobreexpresión de la subunidad mSIN1 en células de mamífero HEK293T. Una vez purificado el complejo mTORC2 se realizaron estudios de la integridad funcional del complejo mTORC2 a través de ensayos in vitro e in vivo en células HEK293T y células U87. Así como, una aproximación estructural del complejo mTORC2 por técnicas de Microscopía Electrónica. La purificación del complejo mTORC2, se consiguió gracias a la obtención de una línea estable de células HEK293T que sobreexpresaban la subunidad específica del complejo mTORC2, mSIN1. La caracterización bioquímica del complejo mTORC2 demuestra que este se encuentra formando dímeros. Los ensayos in vitro indicaron que el complejo mTORC2 mantenía íntegra su actividad quinasa, puesto que se observó un aumento en la fosforilación de Akt (Saxton and Sabatini 2017). Debido al importante papel que juega el complejo en el proceso de supervivencia celular, se llevaron a cabo ensayos de viabilidad celular dos líneas celulares: HEK293T y U87 tras introducir el complejo mTORC2 en el interior celular (Saxton and Sabatini 2017). Se observó una disminución de la viabilidad en el caso de la línea celular HEK293T. En ninguna de las dos líneas celulares se detectó la presencia de la caspasa 3, indicador de apoptosis. Sin embargo, los niveles de LC3-II, proteína característica del proceso de autofagia, si se vieron aumentados significativamente tras introducir el complejo mTORC2 en el interior de las células HEK293T. Finalmente, el complejo mTORC2 se sometió al estudio estructural mediante microscopía de transmisión y crio-microscopía. Esta aproximación estructural del complejo mTORC2 muestra la existencia de una cavidad central como consecuencia de la unión de los dos heterodímeros alrededor del cual se disponen las subunidades del complejo mTORC2.