Optimización de la criopreservación (refrigeración y congelación) de espermatozoides de morueco para su aplicación en inseminación artificial a tiempo fijo (IATF) transcervical

Resumen

Las técnicas de reproducción asistida usadas en los actuales programas de selección y mejora genética ovina están orientadas a mejorar la respuesta espermática para incrementar la fertilidad. Esta tesis doctoral fue diseñada para optimizar los procesos de criopreservación de esperma de morueco y conseguir una mejor respuesta celular basada en el incremento del vigor cinético, supervivencia, funcionalidad e integridad morfológica. En el Capítulo 1 se demostró que el método de filtración mediante columnas de Sephadex fue más efectivo al seleccionar espermatozoides tanto en fresco como refrigerado durante 24 horas comparado con los métodos de centrifugación de gradientes de densidad BoviPure, Percoll o Accudenz, debido a una mayor recuperación de espermatozoides con motilidad progresiva, velocidad rectilínea y menor desplazamiento de cabeza. En el Capítulo 2, se evaluó el efecto de la filtración usando columnas de Sephadex, y la suplementación con glicerol a diluyentes a base de leche desnatada UHT o TEST en esperma de morueco refrigerado a largo plazo. Los resultados revelaron que filtración con Sephadex y la adición de glicerol no proporcionaron beneficios extra y el diluyente UHT preservó mejor la motilidad, integridad y funcionalidad del esperma almacenado en refrigeración durante 96 horas que el diluyente TEST. Además, la capacidad de fertilización heteróloga in vitro que incluyó ovocitos bovinos con zona pelúcida intacta y esperma de morueco diluido en UHT, reveló que tanto penetración, fertilización y división celular fueron similares tanto con semen fresco o refrigerado durante 24 o 48 horas. Por consiguiente, en el Capítulo 3, se determinó que la propiedad antioxidante de la Levocarnitina LC provoca una mejora de la motilidad progresiva y velocidad rectilínea de esperma de morueco, y protege las membranas plasmática, acrosomal y mitocondrial cuando se suplementa al diluyente UHT en concentraciones crecientes desde 1 a 10 mM. Además, las pruebas de fertilidad usando LC revelaron tasas de preñez satisfactorias con semen fresco, no obstante, con semen conservado a 5 grados durante 24 horas produjo resultados controvertidos que conduce a más investigaciones a este punto. Finalmente, en el Capítulo 4 se analizó la respuesta espermática a la criopreservación comparando tres protocolos de congelación con velocidades controladas. Los resultados revelaron que un protocolo enfriamiento acelerado en dos pasos de 5 a menos 10 grados Celsius a 5 grados por minuto, y luego de menos 10 a menos 130 grados a 60 grados por minuto produjo una mejor respuesta a crio- supervivencia espermática posdescongelación medidos mayores motilidades, integridad de membranas espermáticas y menor daño de ADN en comparación con otros dos protocolos, uno que simula la congelación con vapores de nitrógeno líquido estático, y otro de enfriamiento acelerado de tres pasos de 5 a menos 5 grados Celsius a 4 grados por minuto, de menos 5 a menos 110 grados a 25 grados por minuto, y finalmente de menos 110 a menos 140 grados a 35 grados por minuto. La presente tesis doctoral concluye que la filtración de esperma de morueco mediante columnas de Sephadex fue más eficiente al seleccionar espermatozoides con una cinética mejorada en comparación con los métodos de centrifugación por gradientes de densidad, no obstante, su efecto en semen almacenado a largo plazo fue limitado; el glicerol no proporciona beneficios extra durante el almacenamiento al largo plazo; la LC mejora la cinética espermática, protege las membranas y produce tasas de preñez satisfactorias; y finalmente el uso un protocolo de congelación de velocidad controlada, que usa 60 grados por minuto alrededor y después del punto de tiempo de la nucleación de hielo, provoca una mejor supervivencia espermática después de la criopreservación.