Estudio y caracterización del microbioma viral en pacientes pediátricos con infección aguda del tracto respiratorio

Resumen

El empleo de la tecnología de secuenciación de nueva generación en el estudio del tracto respiratorio es un hilo conector que nos lleva desde la puesta a punto de la técnica hasta la comprensión de la ecología de la infección respiratoria y basándose en esto hemos desarrollado nuestros objetivos. El estudio del viroma respiratorio de pacientes pediátricos nos permitió desarrollar los protocolos de enriquecimiento por tres métodos diferentes, de enriquecimiento mediante captura por sondas y la amplificación independiente de secuencia por oligonucleótido único. La puesta a punto de técnicas para el estudio de viroma respiratorio de pacientes pediátricos con infección respiratoria permitió la identificación de patógenos en muestras sin diagnosticar por métodos moleculares. Al incluir un grupo control sano se pudo determinar que los virus detectados en pacientes con infección respiratoria no circulaban en población sana. Los resultados del estudio de rinovirus mostraron que los pacientes analizados estaban infectados en su mayoría por rinovirus A. En este análisis destacó la presencia de rinovirus junto con el virus circular Torque Teno en pacientes hospitalizados. La utilización de muestras de seguimiento de determinados pacientes permitió analizar la presencia del virus a lo largo del tiempo, determinar el período de excreción viral y los cambios genéticos que se producen a lo largo del tiempo en unos virus tan heterogéneos como son los rinovirus. La caracterización de viroma de una paciente con una infección respiratoria grave permitió el descubrimiento de un nuevo virus circular. La utilización de la técnica de amplificación por círculo rodante permitió la obtención del genoma completo y la demostración de la presencia de las estructuras moleculares que definen genéticamente a los virus CRESS-DNA: el nomámero conservado y los motivos RCR y Walker A, B y C. La obtención de genoma completo ha permitido el diseño de sistemas de amplificación genómica aplicados al estudio y secuenciación de estos nuevos virus y gracias a ellos se identificaron virus circulares similares que podrían pertenecer a la recientemente publicada familia Redondoviridae. El estudio de caracterización de estos nuevos virus CRESS-DNA describió una baja presencia en muestras pediátricas y permitió su detección en 5 pacientes con neumonía severa negativos a otros virus. En muestras pediátricas del grupo control negativo no fue detectado este virus. La puesta a punto de protocolos de secuenciación de los ocho segmentos que componen el genoma de los virus gripales permitió el estudio y caracterización de los virus de una paciente pediátrica fallecida sin otra causa que una infección gripal y su hermano, ambos coinfectados con virus de la gripe tipo A y tipo B. Inicialmente y por los métodos tradicionales no fue posible detectar la coinfección en la paciente fallecida, demostrando el potencial diagnóstico y la aplicación de este método en el estudio epidemiológico de la gripe. La técnica de enriquecimiento mediante captura por sondas es una alternativa tecnológica que puede mejorar los resultados de los estudios genómicos en el caso de los virus ADN de gran tamaño. Utilizando diferentes protocolos de enriquecimiento directamente en muestras biológicas se han obtenido fragmentos de alrededor de 17000 nucleótidos de nuevos mastadenovirus detectados en murciélagos ibéricos. El impacto de los métodos desarrollados en el estudio genómico de virus aplicados al diagnóstico de pacientes con infección respiratoria aguda y a la caracterización intrínseca de su viroma durante el desarrollo del cuadro clínico asociado, permite profundizar en la caracterización de los virus detectados como antes nunca se había realizado. El papel de los virus en el compartimiento respiratorio y sus relaciones ecológicas aportan una valiosísima información que de manera directa se traduce en un aumento de las posibilidades de estudio de virus en los Laboratorios de Referencia.