Relación de la conexina-43 con la actividad del oncogén c-Src en células madre de glioma

Resumen

[ES] En el Sistema Nerviso Central (SNC) los astrocitos se encuentran comunicados a través de las uniones comunicantes, formando una red cooperativa que mantiene la homeostasis iónica, metabólica y funcional. La comunicación intercelular es fundamental para controlar, entre otros, procesos como la proliferación, la diferenciación de las células y el paso de moléculas como la glucosa. Trabajos previos realizados en nuestro laboratorio mostraron que la inhibición de las uniones comunicantes de los astrocitos en cultivo provocaba un aumento de la proliferación y de la captación de glucosa. Por otro lado, se ha observado en los gliomas, los tumores más frecuentes del SNC derivados de astrocitos, que los niveles de comunicación intercelular y la expresión de la conexina-43 (Cx43), la proteína que forma las uniones comunicantes en los astrocitos, son muy bajos y se correlacionan inversamente con el grado de malignidad. Asimismo, se ha observado en células altamente proliferativas que, tanto la introducción directa del gen de la Cx43, como la estimulación farmacológica de la permeabilidad de las uniones comunicantes reducen la proliferación. Por todo ello, se considera a la Cx43 una proteína supresora de tumores. En nuestro laboratorio se ha propuesto que c-Src, una tirosina kinasa que interacciona con la Cx43, participa en el aumento de la captación de glucosa y de la proliferación en astrocitos. Por otro lado, esta tirosina kinasa presenta una actividad muy elevada en gliomas , que se reduce con la restauración de la Cx43, al menos en las células C6 de glioma de rata . Además, estudios muy recientes muestran que los niveles de expresión de la Cx43 en las células madre de glioma (GSC) son muy bajos y la restauración de Cx43 revierte el fenotipo tumoral de estas células. A pesar de la importancia terapéutica de este efecto, los mecanismos moleculares que relacionan la Cx43 con la proliferación en las GSC no están todavía claros. Por todo ello, el objetivo general del proyecto de Tesis Doctoral, estudiar la posible relevancia clínica de la relación de la conexina-43 y c-Src. Para ello se plantearon diferentes objetivos, los cuales se detallan a continuación. 1- Estudio de la relación de la Cx43 con c-Src en astrocitos in vivo. Para realizar este objetivo realice una estancia predoctoral en el Collége de France, Paris (Francia). Mediante un modelo de lesión neuronal por excitotoxicidad observamos que los astrocitos reactivos se produce una bajada de Cx43 y un aumento en la actividad de c-Src. 2- Estudio de la relación de la conexina-43 con c-Src en células de glioma humano, incluyendo las células madre de glioma. Se analizaron tanto muestras de gliomas humanos concretamente las líneas celulares: HTB 138 (glioma humano, grado II), HTB12 (astrocitoma, grado III), T98G (glioblastoma multiforme, grado IV), U373 (astrocitoma-glioblastoma, grado III). También se analizaron células madre de tumores de pacientes OB1 y TG10. En estas muestras se encontraron unos bajos niveles de Cx43 y una alta actividad de onocgén c-Src. 3- Estudio del efecto de la Cx43 en la modulación de la actividad de c-Src y la proliferación en células madre de glioma. Para realizar este objetivo se puso a punto tanto el silenciamiento mediante siRNAs como la electroporación en GSC. Se utilizaron células denominadas G166, G179, GliNS2 y G144. Para realizar este objetivo se utlizaron dos estrategías: - Pérdida de función. Silenciamiento de la Cx43 mediante siRNA en la línea de GSC G166. Cuando se silencia la Cx43 aumenta la actividad de c-Src y aumenta la proliferación en estas células. - Ganancia de función. Restauración de los niveles de Cx43 en la línea de GSC GliNS2. Se realizó mediante la técnica de electroporación, técnica que pusimos a punto durante este trabajo. Cuando se restauran los niveles de Cx43 disminuye la actividad de oncogén c-Src y disminuye la proliferación de estás células. 4- Estudio de los cambios en el fenotipo de célula madre de glioma tras la restauración de la conexina-43. Como hemos mencionado los gliomas están compuestos de una población heterogénea de células. Algunas de ellas con características de células madre. Muchos autores sugieren que este fenotipo de célula madre es reversible, siendo un punto crítico para la búsqueda de una nueva estrategia terapéutica. Investigamos en este objetivo la posible participación de la Cx43 en la reversión del fenotipo de célula madre. La restauración de Cx43 en GSC, provoca una disminución de Sox2, es un factor de trasncripción relacionado con la autorrenovación de las células madre. Al restaurar la Cx43 se produce un cambio de cadherinas, hay una ganacia de E-cadherina y una pérdida de N-cadherina. Por lo tanto las células con Cx43 disminuye la autorrenovación y pierden marcadores metástaticos. Además al restaurar la Cx43 también disminuye Id1, un inhibidor de la diferenciación que juga un papel crítico, modulando la invasividad en células de glioma. 5-Estudio de la participación de c-Src en el efecto de la Cx43 en la reversión del fenotipo de célula madre de glioma. Id1 esta regulado por la actividad de c-Src en diferentes tipos de tumores. La inhibición de la actividad de c-Src disminuye la expresión de Id1, Sox2 y se produce el cambio de cadherinas. Una vez conocido el efecto de la inhibición de c-Src sobre el fenotipo de las GSC, quismos confimar la particpación de c-Src en el efecto de la Cx43 sobre el cambio de fenotipo de célula madre. Para ello, diseñamos un péptido penetrante incluye la secuencia del carboxilo terminal de la Cx43, que contiene el dominio de unión a c-Src y las dos tironsa que fosforila esta kinasa. Nuestros resultados muestran que este péptido entra en las GSC y disminuye la expresión de Id1, N-cadherina y Sox2 mientras que aumenta la expresión de E-cadherina. Como conclusión final de este trabajo podemos resumir que: La conexina-43 es una proteína especializada en la comunicación intercelular que, además de formar canales intercelulares, posee un extremo carboxilo terminal con el que interacciona con diversas proteínas señalizadoras. En este sentido, nuestros resultados confirman la relevancia de la relación del extremo carboxilo terminal de la Cx43 con la tirosina kinasa c-Src en astrocitos y células de glioma, incluidas las células madre de glioma. Así, c-Src es responsable de la reversión del fenotipo de célula madre de glioma que ocasiona la restauración de la Cx43 en estas células. La determinación de este mecanismo nos ha permitido diseñar un péptido penetrante con capacidad de revertir el fenotipo tumorigénico de las células madre de glioma humano. Puesto que la reversión del fenotipo de célula madre se propone como una prometedora estrategia para el tratamiento de estos devastadores tumores, pensamos que este péptido penetrante tiene un importante potencial terapéutico.