Estudio de los receptores y mecanismos de entrada de los paramixovirusvirus respiratorio sincitial y virus de la enfermedad de Newcastle
- Holguera Baez, Javier
- Isabel Muñoz Barroso Director
- Enrique Villar Ledesma Director
Universidade de defensa: Universidad de Salamanca
Fecha de defensa: 15 de setembro de 2012
- María de las Nieves Pérez González Presidente/a
- Ángel Hernández Hernández Secretario/a
- Francisco Gavilanes Franco Vogal
- José Javier García Ramírez Vogal
- José Antonio Melero Fondevilla Vogal
Tipo: Tese
Resumo
[ES] Los paramixovirus son virus RNA (-), responsables de diferentes enfermedades en humanos y animales. Concretamente, el Virus Respiratorio Sincitial (RSV) provoca al año la muerte de entre 77.000 y 200.000 niños y la hospitalización de más de 20 millones de individuos. Actualmente no se posee ni vacuna ni tratamiento eficaz. Por su parte, el Virus de la Enfermedad de Newcastle (NDV) provoca importantes pérdidas económicas en granjas avícolas. El ciclo de vida de los paramixovirus comienza con la interacción del virus con la célula hospedadora. Las proteínas de unión del virus reconocen receptores específicos de la superficie celular. Estas proteínas con la proteína G en el caso del RSV y la proteína HN en el caso de NDV. El segundo paso consiste en la fusión de las membrana vírica y celular, lo cual se produce gracias a la actividad fusogénica de la proteína F (de fusión) del virus. Este paso resulta crítico para la entrada del virus ya que bien se puede producir por fusión directa a nivel de la membrana citoplasmática, o bien el virus puede penetrar mediante endocitosis y fusionar posteriormente con las membranas endocíticas. Ambos mecanismos acaban produciendo la liberación del genoma vírico en el citoplasma celular donde podrá generar nuevos viriones. Actualmente se desconocen los mecanismos concretos que regulan el reconocimiento del receptor y fusión de membranas de los paramixovirus, y concretamente del Virus Respiratorio Sincitial (RSV), con la membrana de la célula diana. En los últimos años se ha profundizado en el estudio de los mecanismos de endocitosis, viéndose que muchos virus la utilizan ya sea en exclusividad o complementariamente a la fusión directa con la membrana plasmática, cómo es el caso del RSV y NDV. El conocimiento de los receptores específicos y de los mecanismos concretos de entrada de estos virus permitirá establecer las estrategias en el desarrollo de terapias antivíricas. Esto es especialmente importante ya que se carece de tratamientos específicos para la infección por RSV, limitándose a tratamientos paliativos, y puede ayudar al desarrollo de nuevas terapias frente al RSV. Los objetivos abordados fueron: Objetivo 1.- Identificar los receptores de los paramixovirus, RSV y NDV, de la superficie de la célula hospedadora. Hemos utilizado diferentes inhibidores de la glicosilación de proteínas con el fin de conseguir caracterizar el tipo de residuos que forman parte de las proteínas receptoras celulares del RSV. El RSV precisa receptores O-glicosilados para la entrada en la célula diana y la O-glicosilación y N-glicosilación para la correcta maduración de las proteínas de los nuevos viriones. En el caso del NDV, nuestros datos indican que el remodelado del patrón de glicolípidos de la membrana diana mediante la expresión de sialidasas de mamífero disminuye la fusión e infectividad víricas. Además, mediante la técnica de VOPBA se aislaron las proteínas receptoras específicas de cada virus, para su posterior secuenciación e identificación. Hemos visto que el NDV interacciona con la Proteína Disulfuro Isomerasa (56kDa), y que el RSV interacciona con proteínas de 28 y 55 kDa Objetivo 2.- Estudiar el efecto del pH y la temperatura sobre la fusión de los paramixovirus con células de cultivo. Nuestros datos muestran que los tratamientos a pH ácido incrementan la cinética de la fusión del RSV, si bien no se ve ningún aumento de la fusión a tiempos largos. Esto podría ser debido a que el pH este facilitando un cambio conformacional de la proteína F que no ocurre in vivo. En el caso del NDV los tratamientos a pH ácido provocan una disminución en la cinética de fusión aunque hay aumento global de la fusión a pH ácido. Objetivo 3.- Analizar la entrada del NDV y RSV por mecanismos endocíticos. Los tratamientos con diferentes inhibidores de la endocitosis y experimentos de colocalización nos indicaron que el NDV la utilizaría como mecanismo accesorio de entrada en la célula diana. En el caso del RSV existe controversia acerca de si el RSV utilizaría la ruta endocítica; nuestros datos parecen apoyar que el RSV no utilizaría dicho mecanismo de entrada. Objetivo 1.- Identificar los receptores de los paramixovirus, RSV y NDV, de la superficie de la célula hospedadora. 1.- Los GAGs se encuentran unidos a glicoproteínas. Por ello utilizamos diferentes inhibidores de la síntesis de glicoproteínas: tunicamicina y desoximanojirimicina, inhibidores de la N-glicosilación; y BenzilGalNAc como inhibidor de la O-glicosilación. El efecto de la glicosilación se determinó estudiando la fusión célula-célula (transferencia de sondas fluorescentes), la formación de sincitios, la infectividad (inmunofluorescencia) y el grado de unión del virus a la célula (citometría de flujo). 2.- Para ampliar el conocimiento del papel de los acidos sialicos en la unión y fusión del NDV con la célula hospedadora, sobreexpresamos la sialidasa NEU3 mediante transfección transitoria. Con ello modificamos el patrón de gangliósidos (sialoglicolípidos) de la membrana de la célula diana. Observamos cómo ello afecta a la fusión virus-célula y a su infectividad, mediante microscopía de fluorescencia. 3.- El tercer grupo de experimentos consistió en realizar diferentes pruebas de VOPBA. Esta técnica analiza la interacción in vitro del virus con proteínas transferidas a una membrana de PVDF. Las proteínas positivas se secuenciaron y caracterizaron por espectrofotometría de masas. Objetivo 2.- Estudiar el efecto del pH y la temperatura sobre la fusión de los paramixovirus con células de cultivo. El efecto del pH y la temperatura en la fusión se analizó mediante diferentes aproximaciones: 1.- En primer lugar se midió la fusión de los virus marcados con la sonda octadecil-rodamina (RSV-R18 y NDV-R18) con células en cultivo y con envolturas reconstituidas de eritrocitos (ghosts). En estos experimentos se analizó el efecto del pH sobre la cinética de la fusión (técnicas fluorimétricas) y el número de células positivas para la señal de rodamina (microscopía de fluorescencia). También se sometió a células preinfectadas con RSV a diferentes pulsos de pH ácido y se analizó cómo afecta dicho pH a la actividad de las proteínas víricas expresadas en la superficie de las células. La infectividad se analizó midiendo la formación de sincitios y mediante inmunofluorescencia. La infectividad de virus preincubados a pH ácido se cuantificó mediante recuento de sincitios e inmunofluorescencia. Objetivo3.- Analizar la entrada del NDV y RSV por mecanismos endocíticos. Para comprobar si estos virus utilizan estas rutas de entrada se trataron células de cultivo con diferentes inhibidores de la endocitosis. El efecto de los tratamientos sobre la entrada de los virus se analizó mediante citometría de flujo, inmunofluorescencia, recuento de sincitios y microscopía confocal. Los inhibidores utilizados fueron los siguientes: 1.- Bisindolilmaleimida: inhibidor de la proteína kinasa C necesaria para la endocitosis mediada por receptor. 2.- Dinasore: Inhibidor de la actividad GTPasa de la dinamina 1, inhibe la endocitosis de mediada por clatrina y también por caveolas. 3.- Concanamicina A: Inhibidor de la ATPasa vacuolar necesaria para producir la bajada de pH que permita entrar en las células a virus que requiren pH ácido. 4.- Monensina: Ionóforo que previene la acidificación del endosoma y por tanto inhibe la entrada de virus que requieren pH ácido. 5.- Cloroquina: Es un agente lisosomotrópico que alcaliniza las vesículas endocíticas. 6.- Nocodazol: Despolimeriza los microtúbulos 7.- Metil-beta-ciclodextrina: Agente que secuestra selectivamente colesterol de las membranas en inhibe la formación de vesículas rodeadas de clatrina y endocitosis mediada por caveolas. 8.- PMA: Compuesto inhibidor de la endocitosis mediada por caveolas al fosforilar caveolina. 9.- Nistatina: Antibiótico que se une a esteroides, inhibe la endocitosis mediada por caveolas al eliminar colesterol de la membrana. 10.- Clorpromacina: Compuesto catiónico anfipático que inhibe el reciclado de clatrina y por tanto la endocitosis mediada por esta proteína. Conclusiones: 1. La interacción del NDV con gangliósidos GD1a determina la infección productiva del NDV. El GD1a es un receptor determinante de la célula a infectar. 2. El NDV interacciona in vitro con la Proteina Disulfuro Isomerasa A3. 3. El NDV muestra un movimiento organizado y dirigido en la superficie de células HeLa, movimiento que depende del citoesqueleto. 4. Las proteínas del NDV colocalizan con marcadores de endosomas tempranos a los 30 min postinfección. 5. El NDV puede entrar en la célula huésped mediante endocitosis mediada por caveolas, ya que los inhibidores de esta ruta afectan a la formación de sincitios, a la infectividad del NDV y a la colocalización con endosomas tempranos. 6. La O-glicosilación de las proteínas de la membrana diana del RSV es esencial para la unión, fusión del virus con la célula y la formación de sincitios. 7. El grado de N-glicosilación de las proteínas de la membrana diana del RSV no afecta a la unión ni a la fusión directa del RSV con la célula diana, mientras que la N-glicosilación es esencial para la maduración e infectividad de la progenie. 8. El RSV interacciona in vitro con proteínas diferentes a los proteoglicanos como la nucleolina. 9. El pH ácido activa la fusión del RSV con células de cultivo. 10. El RSV utiliza mecanismos de entrada endocíticos no dependientes de clatrina.