The application of mercury-containing labels in protein analysis using complementary mass spectrometric techniques

Resumo

En la presente tesis doctoral se desarrollaron nuevas metodologías para el análisis cuantitativo de proteínas basadas en la introducción química de un compuesto de mercurio capaz de unirse a las cisteínas libres de estas biomoléculas. El ácido hidroximercuribenzoico tiene un alto potencial como agente derivatizante, ya que es capaz de actuar de forma selectiva y completa sobre los residuos de cisteína presentes en las proteínas. El objetivo fundamental del proyecto ha sido la utilización de la espectrometría de masas elemental como sistema de detección para proteínas, dado que esta técnica puede proporcionar límites de detección muy bajos. Además, otra característica muy destacable es la posibilidad de llevar a cabo el análisis con dilución isotópica utilizando el reactivo con isótopos enriquecidos de mercurio, lo que puede mejorar notoriamente la exactitud de los resultados. Para la optimización del método se investigaron parámetros que pueden afectar a la formación del bioconjugado, como son el tiempo de reacción y el exceso de agente reactivo derivatizante. Tras una etapa de limpieza de las proteínas derivatizadas, se investigó la estequiometria mediante técnicas de espectrometría de masas molecular, como el electrospray. Se encontró que el Agente derivatizante reaccionó únicamente con los sitios de enlace sospechados, es decir, las cisteínas libres. Estos sitios de enlace quedaron claramente identificados mediante un análisis MS/MS. En la segunda parte de la tesis se aplicaron diferentes protocolos para la separación de proteínas, con el fin de comprobar la aplicabilidad general del proceso de marcaje y para demostrar el potencial de la detección mediante fuente de plasma con acoplamiento inductivo (ICP) en combinación con la dilución isotópica específica al compuesto de marcaje con mercurio enriquecido en el isótopo 199. Una caracterización posterior indicó que no hay diferencias entre los productos formados con el compuesto adquirido comercialmente y los formados con el sintetizado, y que también la composición isotópica se ha mantenido durante las dos etapas (síntesis y derivatización). Para demostrar el potencial de la metodología, se eligió como modelo la proteína ovoalbúmina. Esta proteína fue cuantificada de forma exacta tras una separación eletroforética en geles de poliacrilamida utilizando la técnica de ablación laser acoplado al ICP-MS. El estudio demostró que otras estrategias de cuantificación, como por ejemplo la calibración externa, aportan resultados erróneos, ya que están alterados por una distribución no homogénea de la proteína en cada mancha del gel. Como segunda aplicación se cuantificó la ovoalbúmina añadida al suero humano con un protocolo de separación multidimensional (electroforesis en gel seguida por digestión enzimática y análisis de péptidos). Aunque las diferentes etapas de separación provocan pérdidas del analito, lo cual alteraría el resultado final, la dilución isotópica empleada compensó estas pérdidas y permitió obtener resultados satisfactorios para la recuperación de la proteína alladida. Como parte final de la tesis, se investigaron proteínas que potencialmente pueden enlazar metilmercurio in vivo en un material de referencia certificado de tejido muscular de atún. Aunque la determinación de metilmercurio es un tema de alto interés en química analítica, los conocimientos sobre sus lugares de enlace en los tejidos son escasos. A pesar de ello, existen diferentes estudios que indican que el comportamiento químico y toxicológico de este compuesto varía según el tipo de enlace. Tras la evaluación de la eficacia de extracción de diferentes métodos a través de un análisis total de mercurio con dilución isotópica, se procedió a la investigación de su distribución en fracciones de proteínas de diferente peso molecular. Utilizando técnicas de espectrometría de masas complementarias (tanto el ICP-MS como el ESI-MS ), se encontró que el metilmercuio se enlaza preferentemente a una fracción de proteínas de alto peso molecular, identificando una de ellas como la skeletal muscle myosín.