Desarrollo de estrategias nanobioanalíticas de elevada sensibilidad para el control de biomarcadores de enfermedades

Résumé

Durante los últimos años se ha realizado un extraordinario esfuerzo investigador en la búsqueda de marcadores biológicos de enfermedades (“biomarcadores”), es decir, de biomoléculas o compuestos químicos, que pudieran indicar la presencia/ausencia de enfermedades. En el caso concreto del cáncer, es clave disponer de biomarcadores de “alarma temprana”, es decir, biomarcadores que permitan la detección precoz de la enfermedad para iniciar el tratamiento en los estadios iniciales, aumentando así las probabilidades de curación. Uno de los principales problemas que presenta la detección de biomarcadores de “alarma temprana” es la necesidad de detectar niveles muy bajos de concentración de estas sustancias en muestras complejas, lo que requiere de metodologías de bioanálisis extremadamente sensibles. En este contexto, la presente Tesis Doctoral se centra en el desarrollo de inmunoensayos de alta sensibilidad para la detección de biomarcadores basados en dos vías principales: (1) el empleo de marcas fotoluminiscentes que presentan tiempos de vida en el orden de los milisegundos (quantum dots fosforescentes y complejos de lantánidos), y su detección mediante sistemas de tiempo resuelto, (2) amplificación de la señal analítica mediante el empleo de nanopartículas inorgánicas como marcas y su posterior detección por espectrometría de masas de elemental. En primer lugar, se sintetizaron quantum dots (QDs) de ZnS dopados con manganeso y se modificó su recubrimiento superficial con el fin de obtener unas mejores propiedades fotoluminiscentes. Se realizó una caracterización exhaustiva de estas nanopartículas empleando diferentes técnicas analíticas complementarias (XRD, ICP-MS, etc.) para conocer su morfología, estructura cristalina, composición y propiedades luminiscentes. La información obtenida permitió estimar la concentración en número de nanopartícula y la estequiometria ligando-nanopartícula en una muestra dada. Estos estudios previos fueron de vital importancia para llevar a cabo su posterior aplicación como marcadores fotoluminiscentes. En este sentido, se estudió su funcionalización con anticuerpos y se evaluó el potencial analítico de los ZnS QDs dopados con manganeso como nuevos indicadores directos para el desarrollo de un inmunoensayo fosforescente para la detección del antígeno prostático específico (PSA) en muestras biológicas. Las metodologías bioanalíticas basadas en fenómenos de transferencia de energía de resonancia de Förster con detección por tiempo resuelto (TR-FRET) empleando complejos fotoluminiscentes de lantánidos son muy prometedoras para llevar a cabo la detección de biomarcadores, ya que consiguen reunir todas las cualidades necesarias para este tipo de aplicaciones (rapidez, simplicidad, alta sensibilidad y capacidad de análisis multianalito). Por ello, en otra etapa de la Tesis Doctoral se evaluó el empleo de micropartículas magnéticas y de latex como soportes sólidos en inmunoensayos TR-FRET para la detección de PSA (empleando pares lantánido-colorante) con el fin de incrementar la sensibilidad. Posteriormente se estudió la biofuncionalización, y se evaluó el empleo de quantum dots de CdSe/ZnS como marcas en inmunoanálisis utilizando la espectrometría de masas elemental con fuente de plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS) para su detección. La estrategia desarrollada se aplicó a la cuantificación de varias proteínas presentes en el suero (inmunoensayo multiparamétrico). En este sentido, los quantum dots constituyen una marca amplificada para esta técnica de detección, cuya señal es directamente proporcional al número de átomos presentes. Finalmente, se desarrolló un inmunoensayo altamente sensible para la detección de PSA, basado en la combinación de dos estrategias de amplificación empleando nanomateriales. Para ello, se estudiaron las propiedades catalíticas de los QDs para la deposición de oro sobre su superficie. Las propiedades catalíticas se emplearon para amplificar los QDs tras el inmunoensayo, obteniendo estructuras metálicas de mayor tamaño. Ya que el número de átomos se incrementó significativamente con respecto a los QDs sin amplificar, la señal medible mediante ICP-MS se vio extraordinariamente amplificada. Este procedimiento permitió alcanzar unos límites de detección extremadamente bajos (concentraciones ag mL-1 de PSA).