Desarrollo y caracterización de anticuerpos monoclonales frente a componentes del sistema del complemento humano. Aplicación diagnóstica y terapéutica

Resumen

El Sistema del Complemento (C’) es uno de los principales integrantes de la defensa innata del hospedador vertebrado pero, además, constituye un sensor de reconocimiento de señales extrañas y/o de peligro de vertebrados que, junto con las familias de receptores Toll y de proteínas citoplásmicas NLR, desempeña un papel primordial en la inducción y desarrollo de la respuesta inmune adaptativa. Está integrado por unas 30 proteínas plasmáticas y de la superficie celular de leucocitos y de otros tejidos. Algunos de sus componentes son zimógenos que se activan por proteólisis en forma de cascada siguiendo un proceso amplificador que genera respuestas efectoras de gran intensidad y rapidez. Alteraciones en los mecanismos homeostáticos del complemento dan origen a diversas patologías. Entre sus mecanismos efectores se incluyen la opsonización, el desarrollo de respuestas inflamatorias con liberación de potentes anafilatoxinas, la destrucción de células y microorganismos por acción de la cascada citolítica, y la solubilización y aclaramiento de inmunocomplejos (IC) opsonizados potencialmente lesivos para el organismo. Se conocen tres vías de activación del complemento, la vía clásica (VC), la de las lectinas (VL) y la alternativa (VA). Aunque descritas como independientes, suelen activarse simultáneamente y confluyen en la proteólisis del C3, el componente central del sistema. La finalidad de esta Tesis Doctoral fue obtener y caracterizar anticuerpos monoclonales (AcM) frente a proteínas del C’ y utilizar los mejores para el diseño de inmunoensayos que permitiesen identificar disfunciones del mismo en patologías asociadas con procesos inflamatorios, enfermedades autoinmunes o infecciones recurrentes. También seleccionar los AcM que, por sus características, fueran adecuados para dirigirse a puntos clave de las vías (dianas) para el control de la activación del C’. Se han caracterizado AcM frente a los componentes de la VC (C1q y C4), de la VA (factor B (fB), factor D (fD), factor H (fH) y Properdina (P), C3/iC3b/C3d, y de la Vía Lítica (C5 y C9), lo que permitirá el empleo de los mismos en inmunoensayos como: ELISA indirecto (ELISAi), ELISA de captura (ELISAc), western-blot (WB), Citometría de flujo (CF) e inmunohistoquímica. Además, se han obtenido AcM frente al fB, integrante de la C3 y C5 convertasa de la vía alternativa; frente al C5; y frente al C5a, la anafilotoxina más potente generada e involucrada en enfermedades autoinmunes con base inflamatoria. Empleando los AcM anti C5 y C9 se diseñaron dos ensayos tipo ELISA: 1) uno de ellos permite un análisis cualitativo de la activación del C’ simultáneamente por las tres vías; VC, VL y VA. Este ensayo se puso a punto con sueros humanos normales, posteriormente fue probado en 191 sueros procedentes de una seroteca de nuestro laboratorio y, por último, los resultados fueron contrastados con los obtenidos con un ELISA comercializado para el mismo fin en un grupo más reducido de muestras. Los resultados obtenidos con estos sueros, representativos de la población general adulta trabajadora, mostraron que el 85% de la población tiene funcional las tres vías de activación del C’; que el 95% tiene íntegras la VC y la VA; y que el 100% de los individuos analizados son capaces de activar el C’ por la VC. 2) El otro inmunoensayo desarrollado es un ELISA tipo sándwich que permite la cuantificación de la concentración del complejo soluble C5b-9 (SC5b-C9) en suero. Su puesta a punto se llevó a cabo con el SC5-9 purificado y se testó posteriormente en los mismos 191 sueros mencionados. A pesar de que este complejo está asociado a enfermedades que cursan con una elevada activación del complemento, se detectó su presencia en el 11% de los sueros obtenidos de una población teóricamente sana. Los AcM obtenidos a lo largo de este trabajo y la caracterización funcional de los mismos mediante la determinación de la inhibición de la actividad del C’ por la VC con un anti-C3b, de la VA con un anti-P, y de la Vía Lítica con un anti-C9, proporcionan nuevas herramientas que deberán ser evaluadas en el futuro para valorar su posible utilidad como agentes inmunomoduladores en las alteraciones inflamatorias originadas por una activación exacerbada del C’.