Aplicación de las técnicas de secuenciación masiva al estudio de la infección por Helicobacter Pylori

Resumen

INTRODUCCIÓN Las técnicas de secuenciación han evolucionado con rapidez desde su desarrollo en la década de 1970. Actualmente, las técnicas de secuenciación masiva permiten obtener millones de secuencias en poco tiempo, lo que ha permitido secuenciar genomas completos (eucariotas y procariotas) y también estudiar el microbioma humano. El objetivo de este trabajo es explorar la aplicabilidad que las técnicas de secuenciación masiva pueden tener en el estudio de la infección por Helicobacter pylori, un bacilo Gram negativo microaerofílico que coloniza la mucosa gástrica humana pudiendo generar patologías como la gastritis, úlcera péptica, carcinoma gástrico y linfoma tipo MALT. El trabajo se estructura en una primera sección de secuenciación de 20 genomas de H. pylori con el estudio de los factores de virulencia, el tipado in silico de las cepas mediante estudio de MLST y estudio del pan-genoma y una segunda sección de estudio del microbioma gástrico, comparando los resultados de dos técnicas de secuenciación masiva (454 de Roche y MiSeq de Illumina) en pacientes colonizados y no colonizados por H. pylori, así como una aproximación a la actividad transcripcional de los microorganismos detectados. MATERIALES Y MÉTODOS Se incluyeron en el estudio 39 pacientes pediátricos a los que se realizó endoscopia digestiva para toma de biopsia de antro gástrico. De ellos, 28 fueron H. pylori positivos (cultivo de H. pylori a partir de biospia positivo): 18 se incluyeron en el estudio de genomas, 8 en el de microbioma y 2 en ambos. Los 11 restantes fueron H. pylori negativos (cultivo negativo de H. pylori a partir de biospia y prueba de ureasa rápida negativa): todos ellos incluidos en el estudio del microbioma. Para cada cepa incluida en el estudio de genomas se realizó secuenciación de alto rendimiento del genoma completo mediante el equipo MiSeq (Illumina). Para las biopsias incluidas en el estudio del microbioma se realizó estudio de la densidad bacteriana mediante qPCR del 16S y estudio del microbioma de forma paralela mediante secuenciación del gen ARNr 16S por tecnología MiSeq (Illumina) y 454 (Roche). El estudio de la actividad transcripcional se realizó únicamente mediante tecnología MiSeq (Illumina). El análisis de resultados de los genomas secuenciados se realizó utilizando las herramientas informáticas PROKKA v1.12, virtual MLST 2.0, build_PGAdb, build_wgMLSTtree e iTOL. Los análisis de microbioma gástrico se llevaron a cabo utilizando la plataforma QIIME v1.8.0 y SPSS 15.0. RESULTADOS Mediante el análisis de los genomas completos se comprobó que la mayoría de cepas estudiadas presentan perfiles poco virulentos (4 de las 20 cepas eran cagA positivas con motivos EPIYA tipo ABC y -BC y 5 de las 20 cepas presentaron el alelo s1 de vacA). También se objetivó que el tipado mediante MLST no es útil en el caso de H. pylori y que el estudio del pan-genoma y más concretamente del genoma core permite apreciar relaciones filogenéticas de forma más precisa. En el estudio del microbioma gástrico, se observó que la densidad bacteriana en las biopsias varía entre los pacientes H. pylori negativos y positivos, siendo mayor en los positivos. El estudio mediante secuenciación masiva puso de manifiesto diferencias entre las dos técnicas utilizadas, principalmente a nivel de alfa diversidad, ya que se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas en el índice de Shannon entre los pacientes H. pylori negativos y positivos al trabajar con tecnología MiSeq, pero no con 454. En cuanto a la beta diversidad, se observaron diferencias estadísticamente significativas al analizar los resultados obtenidos mediante la tecnología MiSeq y 454 en función del resultado del cultivo tanto en el análisis cualitativo como cuantitativo. Al realizar el análisis en función de los hallazgos histológicos, se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas (en el análisis cualitativo y cuantitativo) únicamente mediante tecnología MiSeq. En el análisis taxonómico a nivel de filo se observó una diferencia en el grupo H. pylori negativo en la abundacia relativa de los filos Proteobacteria (el más abundante por tecnología MiSeq) y Firmicutes (el más abudante por tecnología 454), pero no se observó en el grupo de H. pylori positivos. A nivel de género, los resultados en el grupo H. pylori positivos fueron similares, pero en el grupo H. pylori negativos, se observaron abundancias relativas entre el 2 y el 9% por tecnología MiSeq en géneros que apenas tuvieron representación por tecnología 454. En cuanto al análisis de actividad transcripcional, los géneros Streptococcus, Haemophilus, Neisseria, Veillonella y Prevotella, se encontraron más activos en las muestras provenientes de pacientes H. pylori positivos, mientras que el género Helicobacter apareció más activo en las muestras de pacientes H. pylori negativos. CONCLUSIONES El anáisis de genomas completos permite concluir que las cepas que circulan en nuestro entorno son, en general, poco virulentas, que el genoma core de H. pylori comprende un bajo porcentaje del total de genes presentes en su cromosoma y disminuye al incorporar cepas de diversos orígenes geográficos. Además, las cepas de H. pylori son genéticamente diversas y no presentan, en general, relaciones filogenéticas entre ellas. En cuanto al estudio de las biopsias gástricas, se ha podido comprobar que la densidad bacteriana analizada mediante qPCR es diferente entre pacientes H. pylori positivos y H. pylori negativos. El microbioma gástrico presenta diferencias entre H. pylori positivos y negativos en cuanto a alfa-diversidad mediante tecnología MiSeq. En cuanto a beta diversidad, existen diferencias entre pacientes H. pylori positivos y H. pylori negativos tanto en el análisis por 454 como por MiSeq y mientras que solamente se observan diferencias en función de los hallazgos histológicos en el análisis mediante MiSeq. El estudio taxonómico revela un predominio de los filos Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes y Actinobacteria en los pacientes H. pylori positivos y negativos. Helicobacter es el género predominante en las muestras de pacientes H. pyori positivos y Streptococcus en los pacientes H. pylori negativos, independientemente de la plataforma de secuenciación utilizada. El uso de diferentes protocolos de secuenciación implica diferencias en los resultados, fundamentalmente a nivel de alfa diversidad y análisis de la composición taxonómica. Es posible detectar secuencias de ARN bacteriano en biopsias gástricas de pacientes con y sin infección por H. pylori que orientan a pensar en una comunidad bacteriana estable y activa en el estómago.