P.Falciparum humanized mouse modelcharacterization and further studies for antimalarial drug development

Resumen

Resumen La Malaria es una enfermedad parasitaria que en humanos está causada por 5 especies diferentes de protozoos del género Plasmodium que infectan y destruyen eritrocitos. De estas 5 especies, Plasmodium falciparum es la más patogénica y causa la mayoría de las muertes por malaria. Esta mortalidad ocurre fundamentalmente en niños menores de 5 años en el África Subsahariana. El parásito de la malaria tiene un ciclo de vida complejo, que incluye 2 tipos de hospedadores: el mosquito y el humano. En el humano se desarrollan las fases asexuales del parásito, que constan del ciclo exoeritrocítico y el ciclo intraeritrocítico. El primero se desarrolla en hígado donde los esporozoítos, provenientes de las glándulas salivares de los mosquitos después de la picadura, se introducen en los hepatocitos y se multiplican generando miles de merozoítos que son liberados al torrente sanguíneo dispuestos a infectar eritrocitos. Una vez los merozoítos han conseguido introducirse dentro de los eritrocitos comienza la fase eritrocítica, donde el parásito se desarrolla pasando por diferentes estadíos: anillo, trofozoíto y esquizonte. El esquizonte está constituido por varios merozoítos que después de la ruptura del eritrocito infectado son liberados al torrente sanguíneo con capacidad de infectar nuevos eritrocitos. Esta fase intraeritrocítica dura 48 horas y es en la que se ha basado la presente tesis. En el hospedador humano se forman las fases sexuales del parásito, los gametocitos, que son adquiridos por un mosquito después de una picadura. En el estómago del mosquito tiene lugar la reproducción del parásito dando lugar a un zigoto, que posteriormente se desarrolla en un ooquiste que se ancla en la pared exterior del estómago del mosquito. En el ooquiste tiene lugar una multiplicación masiva para formar los esporozoítos que una vez liberados del ooquiste migran hacia las glándulas salivares del mosquito donde en una nueva picadura del mosquito serán liberados comenzando un nuevo ciclo infectivo en el humano. El parásito P. falciparum infecta casi exclusivamente a humanos. En los últimos años, la aparición de resistencias a los tratamientos actuales ha hecho resurgir la necesidad de nuevas estrategias terapéuticas para la erradicación de la enfermedad, lo que implica trabajar en el descubrimiento y desarrollo de nuevos medicamentos. El desarrollo de nuevos fármacos implica el uso de especies preclínicas, generalmente ratón, para probar la eficacia de esos compuestos. Los modelos animales para enfermedades humanas son una herramienta esencial en esta etapa del desarrollo farmacéutico. La generación de ratones inmunodeficientes ha supuesto un gran avance para el estudio de enfermedades humanas. En los últimos años se han desarrollado modelos murinos de malaria humana en los que el parásito P. falciparum es capaz de crecer en sangre periférica de ratones trasplantados con eritrocitos humanos (fase eritrocítica). En este trabajo experimental se ha caracterizado y optimizado el xenotransplante con eritrocitos humanos de un modelo murino humanizado de P. falciparum con el objetivo de obtener un crecimiento robusto y reproducible del parasito que garantice la evaluación de los compuestos antimálaricos. Este modelo ha sido desarrollado en ratones inmudeficientes que carecen de células T, B y NK (NODscid IL2Rnull, abreviado IL2), en los que se obtiene un xenotransplante de eritrocitos humanos robusto y reproducible. En tan solo diez días se obtiene un 50-60% de eritrocitos humanos en sangre de ratón. En este modelo murino el crecimiento de P. falciparum es reproducible y los niveles de parasitemia alcanzados después de la infección son 10 veces superiores a los descritos previamente en modelos murinos humanizados. La optimización del proceso de xenotransplante se ha obtenido mediante el estudio de diferentes regímenes de administración de eritrocitos. Se ha establecido que la inyección diaria de 1 ml de una suspensión de eritrocitos humanos al 50% de hematocrito, es la opción más eficaz y segura para la quimerización de los ratones IL2. Una vez optimizado el protocolo de quimerización, los ratones fueron inyectados por vía intravenosa con 20x106 de eritrocitos infectados con la cepa adaptada P. falciparum 3D70087/N9. Se observó un crecimiento exponencial y asincrónico del parásito en el que todos los estadíos eritrocíticos estaban presentes. La duración del ciclo fue de 48 horas y es similar al que presenta el parásito P. falciparum en la infección natural que transcurre dentro del hospedador humano. En el modelo murino humanizado de P. falciparum los eritrocitos humanos inyectados son aceptados como propios del ratón y son funcionales, ya que se consigue una completa sustitución de los eritrocitos del ratón. Un estudio completo sobre el rechazo y aceptación de estos eritrocitos ha sido llevado a cabo en este trabajo, y se ha podido determinar que en una primera instancia los eritrocitos humanos son rechazados por el sistema inmune innato, pero con las administraciones diarias finalmente son aceptados una vez que el sistema de eliminación se ha saturado. Un estudio detallado de la cinética de eliminación de los eritrocitos humanos en los procesos de quimerización y posterior infección de P. falciparum se ha realizado mediante el marcaje de membrana de los eritrocitos y posterior inyección en los ratones. Estos marcajes no afectaron a la viabilidad de los eritrocitos. En el proceso de quimerización, los resultados obtenidos en el estudio de la cinética demuestran que en primera instancia los eritrocitos humanos inyectados son eliminados rápidamente (5 horas de vida media), esta eliminación se debe al rechazo producido por el sistema inmune innato del ratón, los macrófagos y los granulocitos están implicados en esta primera fase de eliminación. Sin embargo, 13 días después de que el proceso de quimerización comenzara, la vida media de los eritrocitos humanos se ve incrementada considerablemente, comparándose con la vida media de los eritrocitos propios del ratón (10 días), confirmando que el proceso de eliminación de eritrocitos humanos ha sido saturado. En la fase inicial de infección con P. falciparum (fase exponencial), los eritrocitos humanos son eliminados más rápidamente que durante la fase de quimerización (7 días de vida media). Una vez alcanzado el nivel máximo de parasitemia, la eliminación de eritrocitos humanos se acelera y se alcanza una fase de anemia donde los eritrocitos humanos infectados y no infectados son eliminados masivamente (12 horas de vida media). Esta anemia es una respuesta común a la infección por el parásito P. falciparum y tiene también lugar en el hospedador humano. La eliminación masiva de eritrocitos humanos, especialmente en la fase de anemia del modelo, es una desventaja en cuanto al estudio de la infección de P. falciparum en un modelo preclínico. En este trabajo se han explorado diferentes aproximaciones para poder elucidar si la fase de anemia observada está directamente relacionada con el proceso de infección de P. falciparum o es consecuencia del fondo genético empleado en estos estudios. La fase de anemia fue caracterizada utilizando distintas cepas de ratón con distintos niveles de inmunodeficiencia y diferentes cepas de P. falciparum. En todos los casos el proceso de xenotransplante fue similar y susceptible de ser infectado con las diferentes cepas de P. falciparum empleadas, las cuales presentaron una tasa de crecimiento diferente a la 3D7. En ninguno de los casos se evitó la fase de anemia. En el proceso de infección de P. falciparum en el hospedador humano se produce una respuesta inmunitaria en el que la citoquina TNF desempeña un papel fundamental en la eliminación del parásito. Otras citoquinas involucradas en la protección frente a la infección de P. falciparum en el humano han sido descritas, tales como IL6, IL12, IL10 y MCP-1. En el proceso de caracterización del modelo murino de P. falciparum se ha estudiado el papel de diferentes citoquinas, 4 de ellas fueron detectadas principalmente: TNF, IL12, IL10 e IL6, el perfil de secreción varía a lo largo de las distintas fases del modelo: quimerización, infección y anemia. Estas citoquinas median la activación de los macrófagos y granulocitos que son los principales mediadores del proceso de fagocitosis observado de los eritrocitos humanos en el bazo, como se ha demostrado en el ensayo de eritrofagocitosis realizado en este trabajo. La reproducibilidad del xenotransplante con eritrocitos humanos y la infección con P. falciparum nos permite afirmar que este modelo puede ser utilizado para el estudio de los diferentes aspectos de la patofisiología de la malaria humana junto con su uso potencial para la evaluación de fármacos antimaláricos. Los parámetros de eficacia utilizados en el modelo murino de P. falciparum que son la base para predecir las dosis necesarias en los ensayos clínicos son la ED90 (dosis eficaz que elimina el 90% de los parásitos bajo tratamiento), la AUCED90 (cantidad de producto en sangre por hora necesario para eliminar el 90% de los parásitos). Estos parámetros son obtenidos después de un ensayo en el que los ratones infectados son tratados durante 4 días consecutivos, una vez al día, con un rango de dosis diferentes. Durante este ensayo se obtienen muestras diarias de los ratones para medir la parasitemia y durante las primeras 24 horas después del tratamiento se obtienen muestras para medir la cantidad de producto en sangre de los ratones. Una vez finalizado el tratamiento, los ratones que han sido curados se monitorizan durante 28 días para determinar la dosis curativa, que es aquella que no produce recrudescencia después de este periodo de tiempo. La eficacia de dos compuestos antimaláricos comúnmente utilizados en clínica ha sido evaluada, Piperaquina y Atovacuona. Ambos fármacos fueron eficaces frente a P. falciparum en el modelo murino, la respuesta del parásito frente al tratamiento fue diferente. Cuando los ratones fueron administrados con Piperaquina, el parásito fue eliminado rápidamente de la sangre periférica y después de 28 días después de terminar el tratamiento, ningún parásito fue detectado en la sangre periférica de los ratones a las dosis más altas administradas. Sin embargo, la Atovacuona eliminó el parásito más lentamente y después de 18 días después de finalizar el tratamiento, nuevos parásitos fueron detectados en sangre periférica del ratón en todas las dosis testadas. Este fallo terapéutico podría ser el responsable de la aparición de las resistencias observadas en clínica. En este trabajo, la citometría de flujo se ha utilizado como herramienta para la detección de eritrocitos marcados y del parásito. La técnica de citometría usada para la detección del parásito es una combinación de un marcador de DNA (SYTO-16 o YOYO-1) y un marcador de membrana de eritrocitos de ratón (TER119-PE). La combinación de ambos fluorocromos hace posible diferenciar las diferentes fases eritrocíticas del parásito (anillo, trofozoíto y esquizonte). Esta información adicional hizo posible la puesta a punto de un ensayo fenotípico en el que se puede estudiar las fases susceptibles a los diferentes tratamientos antimaláricos que podrían permitir elucidar el mecanismo de acción. Un set de 14 antimaláricos de uso común ha sido evaluado y caracterizados por citometría de flujo en este trabajo. Estos 14 fármacos antimaláricos pertenecen a diferentes familias químicas, se han caracterizado 4 mecanismos de acción diferentes que presentan diferentes velocidades de eliminación de los parásitos en sangre periférica. La lucha contra la malaria incluye la búsqueda de fármacos que afectan a los diferentes estadíos durante la infección del hospedador humano. En los últimos años los esfuerzos por erradicar la malaria se han enfocado tanto en las fases eritrocíticas (asexuales) que son las responsables de la patología de la malaria como en las fases sexuales (gametocitos), que son capaces de mediar en la transición desde el hospedador humano al mosquito. Actualmente no hay disponible ningún modelo animal que permita evaluar la eficacia de fármacos in vivo frente a los estadíos sexuales. Con el fin de desarrollar un modelo animal que permita el estudio del bloqueo de la transmisión diferentes abordajes han sido utilizados. En el proceso natural de producción de gametocitos se empleo la cepa de P. falciparum NF54 adaptada al crecimiento del ratón. La capacidad de infectar mosquitos fue confirmada mediante la presencia de ooquistos en los estómagos de los mosquitos que habían picado directamente a los ratones infectados. La prevalencia de infección fue de un 5% y es comparable a la que se observa en la transmisión natural del parásito del humano al mosquito. En el proceso natural de gametocitogéneis el porcentaje de gametocitos presente en sangre periférica es inferior al 1%, con el fin de incrementar el porcentaje de gametocitos, se realizó un ensayo donde se combinaron herramientas in vitro/in vivo. Gametocitos en el estadío más avanzado (estadío V), fueron inyectados en ratones quimerizados. Una vez comprobada la estabilidad de estos gametocitos en sangre se evaluó su capacidad para infectar mosquitos. En este caso, la prevalencia de infección obtenida fue del 6%, que resulta insuficiente para ser utilizado como un ensayo in vivo para estudiar la capacidad de los fármacos en el bloqueo de la transmisión del parásito del humano al mosquito. Ambas metodologías están en su fase inicial de desarrollo y abren la posibilidad a establecer nuevas vías de enriquecimiento en el proceso de gametocitogénesis in vivo. Los resultados obtenidos en la presente tesis apoyan que el modelo murino humanizado de P. falciparum, es una buena herramienta para el estudio de la infección natural de P. falciparum y permite abordar el desarrollo de nuevos fármacos contra la malaria en estudios preclínicos, la información derivada del modelo murino es clave en la erradicación de la enfermedad.