Nanoclústeres de oro como marcadores para el análisis bimodal de proteínas en muestras biológicas mediante fluorescencia y espectrometría de masas

Resumen

El bioimaging de proteínas específicas en muestras de interés biológico mediante ablación láser (LA) acoplado a un plasma de acoplamiento inductivo – espectrometría de masas (ICP-MS) presenta interesantes características tales como alta sensibilidad, posibilidad de realizar análisis multiparamétricos y análisis cuantitativos. Para ello, es necesario combinar la técnica LA-ICP-MS con inmunohistoquímica (IHC) usando marcadores elementales. En este sentido, los nanoclústeres (NCs) metálicos, con un diámetro inferior a 3 nm, podrían ser unos buenos candidatos como marcadores debido a las propiedades interesantes que ofrecen, entre las que se encuentran la amplificación. Sin embargo, el empleo de estos NCs metálicos para el bioimaging de proteínas empleando LA-ICP-MS todavía no ha sido estudiado. Por otra parte, obtener imágenes de estas proteínas en tejidos biológicos donde se indique la concentración de las mismas (bioimaging cuantitativo) es también una tarea complicada. A lo largo de la presente Tesis Doctoral se ha investigado la síntesis de NCs de oro (AuNCs) fluorescentes y su aplicación para el desarrollo de inmunoensayos y de procedimientos de IHC mediante detección fluorescente y LA-ICP-MS. En el primer capítulo se ha llevado a cabo la síntesis de AuNCs y se han aplicado al desarrollo de un inmunoensayo para la determinación de inmunoglobulina E (IgE) en muestras de suero humano. La proteína IgE se ha elegido como analito “modelo” para estudiar las prestaciones analíticas que presentan los AuNCs como marcadores fluorescentes. La síntesis se ha caracterizado en términos de propiedades ópticas y estructurales, de estabilidad y de concentración. Posteriormente, los AuNCs se han bioconjugado con un anticuerpo que reconoce específicamente a la IgE y se ha desarrollado el fluoroinmunoensayo correspondiente. Tras estudios comparativos, se ha elegido el formato competitivo ya que presentó mejores prestaciones analíticas que el formato sándwich. La aplicación del inmunoensayo a sueros humanos ofreció unos resultados acordes con los obtenidos con un kit comercial ELISA. Dichos resultados muestran un potencial prometedor para el uso de los AuNCs como marca fluorescente. En el segundo capítulo, se han utilizado los AuNCs como marcadores en el desarrollo de un procedimiento de IHC para el estudio de la distribución de metalotioneínas (MTs) en secciones de tejido ocular (región de la retina). Los AuNCs empleados permiten una detección bimodal, empleando microscopia láser confocal (midiendo la fluorescencia de AuNCs) y LA-ICP-MS (detectando el Au). En este estudio, se han elegido MTs 1/2 y MT 3 como analitos “modelo” a fin de evaluar el potencial que presentan los marcadores AuNCs para proporcionar imágenes cualitativas de proteínas por fluorescencia y LA-ICP-MS. Se ha observado que la superficie de los AuNCs ha de ser bloqueada con hidroxilamina para evitar interacciones no específicas con los tejidos. Se han realizado con éxito los inmunoensayos para localizar MTs 1/2 y MT 3 en secciones de tejido ocular y se han obtenido imágenes bidimensionales (2D) para la distribución de MTs 1/2 y MT 3 en las capas de la retina por fluorescencia y por LA-ICP-MS. La amplificación de la señal proporcionada por los AuNCs como marcadores elementales ha permitido obtener imágenes de alta resolución lateral de MTs 1/2 y MT 3 por LA-ICP MS, estando las distribuciones de las proteínas de acuerdo con las obtenidas por IHC convencional. En el tercer capítulo se ha desarrollado una metodología para obtener imágenes cuantitativas de proteínas específicas en tejidos biológicos mediante LA-ICP-MS utilizando AuNCs como marcadores elementales. En este estudio se ha caracterizado la estequiometría del bioconjugado en términos de AuNCs:anticuerpo disponible, obteniendo una relación molar 1:1 relación molar. La señal de 197Au+ detectada por LA-ICP-MS se transformó en concentración usando patrones de gelatina. Finalmente, se han obtenido imágenes cuantitativas 2D de concentración de MTs 1/2 para estructuras micrométricas del tejido ocular. Para validar la metodología propuesta, las concentraciones de MTs 1/2 promedio obtenidas en retina humana por LA-ICP-MS se han comparado con los valores obtenidos con un kit comercial ELISA. En el cuarto capítulo se han obtenido imágenes cuantitativas de Fe y ferroportina (FPN) en secciones de cerebro humano de donantes con Alzheimer y pacientes control (tejido sano) por LA-ICP-MS. La imagen de FPN se ha obtenido empleando AuNCs bioconjugados. En este estudio se ha mejorado la síntesis de AuNCs en términos de homogeneidad de tamaño en comparación con la empleada en los capítulos previos. Para tal fin, se ha utilizado isopropanol en lugar de agua como medio en el que se disuelve el agente reductor. Con los AuNCs bioconjugados con anti-FPN se ha realizado el protocolo IHC y se han analizado los tejidos por LA-ICP-MS. La distribución cuantitativa de FPN obtenida por la metodología propuesta se ha comparado con éxito con los niveles proporcionados por densitometría tras IHC convencional.