Caracterización del mutante nfxB de Pseudomonas aeruginosapapel en la resistencia antibiótica de los biofilms e interacción con los mecanismos de resistencia intrínsecos.

Resum

L’azitromicina ha mostrat resultats prometedors en el tractament de la infecció respiratòria crònica per Pseudomones aeruginosa. No presenta activitat bactericida davant aquest microorganisme en cultiu planctònic, però es sap que aquest macròlid la formació de biofilms gràcies a la seva capacitat per interferir en el sistema quòrum sensing bacterià. En el transcurs de les infeccions cròniques sovint es seleccionen mutants que presenten un grau d’adaptació al nínxol ecològic i als antibiòtics, tal com escau amb el mutant nfxB, gen regulador negatiu de la bomba d’expulsió activa MexCD-OprJ. Aquest fenotip freqüentment és aïllat en mostres respiratòries de pacients amb fibrosi quística, MPOC i bronquièctasis, i es caracteritza per presentar resistència als antibiòtics que poden actuar com a substrat i per presentar una marcada hipersensibilitat als antibiòtics betalactàmics no substrats de la bomba i aminoglucòsids. Un dels principals objectius d’aquest treball va esser esbrinar si durant l’exposició perllongada a azitromicina es seleccionen mutants nfxB tant en cultiu planctònic com en forma de biofilm. Es va avaluar l’impacte de la hiperproducció d’alginat i l’efecte de la hipermutació sobre l’efecte bactericida, sobre la dinàmica de desenvolupament de resistències a azitromicina. També va esser objecte d’estudi la caracterització del mutant nfxB, així com la relació entre la hiperexpresió de MexCD-OprJ (a través de la mutació al seu gen regulador nfxB), la activitat de la cefalosporinasa cromosòmica AmpC, i les bombes d’expulsió intrínseques MexAB-OprM i MexXY-OprM. Per a dur a terme aquests objectius es van construir mutants deficients en el gen mucA, mutS) i la combinació de ambdós. Seguidament s’avaluà el comportament del mutants en dins un biofilm tractat amb diferents concentracions de azitromicina, així com la dinàmica de desenvolupament de resistències durant varis dies. Es caracteritzaren els mutants resistents a azitromicina, es va determinar el seu perfil de sensibilitat, es quantificà l’expressió relativa de mexD i finalment es va seqüenciar el seu gen regulador nfxB revelant diverses mutacions inactivants. En resum, els resultats obtinguts ens han permès demostrar que durant el tractament de biofilms amb azitromicina existeix una selecció de mutants nfxB a les soques salvatges, les hiperproductores d’alginat i particularment a les soques hipermutadores. Seguidament es va construir el mutant nul nfxB i es va procedir a l’avaluació de les seves propietats biològiques, la seva sensibilitat al complement del sèrum humà i la tassa i freqüència de mutació en rifampicina. Finalment es va analitzar el seu transcriptoma, mostrant que aparentment no es sobreexpressen gens implicats en la residència antibiòtica, exceptuant aquells que pertanyen a l’operó mexCD-oprJ. Al perfil de proteïnes fixadores de penicil•lina no es trobaren diferencies entre el mutant nfxB i la soca de referència, però l’anàlisi de proteïnes de membrana externa va revelar una disminució de la expressió de OprM, responsable de la hipersensibilitat a aminoglucòsids i betalactàmics amb l’excepció de l’imipenem. De forma anàloga, la disminució de l’expressió de OprM no justificà la reversió del fenotip de resistència a betalactàmics en el mutant nfxB-dacB. No obstant, la determinació fraccionada (extracte cru, periplasma i sobrenedant) de l’activitat betalactamasa específica del mutant nfxB i del mutant doble nfxB-dacB mostrà un dràstic descens de l’activitat periplasmática com a conseqüència de la inactivació de nfxB, a costa d’un augment de l’activitat mesurada al sobrenedant. Així, les nostres dades revelen que la hipersensibilitat a betalactámics és deguda a la incapacitat per acumular AmpC a l’espai periplàsmic, produint-se una permeabilització cap al medi extracel•lular. No obstant una anàlisi d’aquest fenomen ens ha permès descriure com aquesta permreabilització resulta beneficiosa en el si d’un biofilm tractat amb betalactàmics, degut a que AmpC quedaria reclòs dins la seva matriu. Finalment, les dades preliminars suggereixen que la permeabilització que experimenta AmpC al mutant nfxB ocorre també amb altres betalactamases, particularment de les classes B i D.