Identificación y caracterización funcional de la interacción entre el proto-oncogen c-Fos y la proteína centrosomal CEP2/C-NAP1

Resumen

El objetivo principal de la presente tesis doctoral ha sido la caracterización de la interacción entre el proto-oncogen c-Fos y la proteína centrosomal CEP2/C-NAP1. c-Fos es un factor de transcripción de la familia AP-1 (Activating Protein 1). Los factores AP-1 están implicados en proliferación, muerte, supervivencia, diferenciación celular, respuesta a estrés y transformación oncogénica. Su actividad se induce por factores de crecimiento, citoquinas, neurotrasmisores, luz ultravioleta (UV) y estrés celular. Estos factores presentan un dominio b-ZIP que consta de una región básica de unión a DNA (dominio básico) junto a un motivo de dimerización o de unión a otras proteínas denominado cremallera de leucinas, el cual consiste en repeticiones de residuos de leucina cada siete aminoácidos. Los factores AP-1 dimerizan para unirse al DNA formando homodímeros o heterodímeros lo que altera su capacidad de unión a DNA, la estabilidad proteica o la capacidad de transactivación de los dímeros. Los mecanismos de regulación de la actividad AP-1 son muy complejos, y se produce a diferentes niveles, incluyendo: cambios en la transcripción del gen o recambio del mRNA, efectos en el reciclaje o recambio de la proteína, modificaciones post-traduccionales que modulan su capacidad de transactivación e interacciones con otras proteínas o factores de transcripción que pueden cooperar o interferir con la actividad AP-1. c-Fos pertenece al grupo de genes denominados de respuesta temprana, ya que se expresa de manera rápida y transitoria en respuesta a factores de crecimiento y mitógenos. En células estimuladas con mitógenos se observa un aumento de la expresión de c-Fos, con un máximo a los 90 minutos seguido de una reducción rápida de sus niveles, ya que la proteína es altamente inestable. En la mayoría de los tipos celulares los niveles de expresión de c-Fos son apenas detectables en condiciones de asincronía. CEP2 es una proteína centrosomal de 250 KDa de ratón que tiene un homólogo en humanos denominado CEP2, CEP250 o C-NAP1 (80% de identidad) como describen Fry y cols por primera vez al encontrarla en un ensayo de doble híbrido usando como cebo Nek2 (serina/treonina quinasa de NIMA). Un segundo artículo describe que CEP2 es fosforilada por Nek2 permitiendo así la disyunción de los centriolos en la mitosis, por lo que se ha propuesto que la función de CEP2 es mantener unidos los centriolos de la célula durante la interfase. Por el sistema del doble híbrido en levaduras se identificó la interacción de c-Fos (aa123-230, el cual comprendía el dominio bZIP) con la región COOH-terminal de la proteína centrosomal CEP2 (CEP2Ct), esta interacción se podría producir debido a dominios coiled-coil que se han descrito en la zona C-terminal de C-NAP1. Para confirmar la interacción entre c-Fos y C-NAP1 se realizaró un ensayo de arrastre con GST utilizando GST-CEP2Ct y c-Fos endógeno de células de mamífero que confirmó la interacción, además de demostrar que c-Fos en su configuración nativa era también capaz de interaccionar con CEP2Ct. Los resultados de doble híbrido mostraban que la región bZIP de c-Fos es suficiente para interaccionar con CEP2Ct. Por lo que se mapeó las regiones de CEP2Ct implicadas en la interacción con c-Fos. Para ello se realizaron dos ensayos diferentes: un ensayo de actividad beta-galactosidasa en levaduras y un ensayo de arrastre con GST, que mostraron que la interacción era debida a la región de CEP2Ct aa2233-2293, la cual incluía un motivo de cremallera de leucinas. Además, no se producía interacción con un fragmento restringido exclusivamente la cremallera de leucinas (aa 2239-2267), sugiriendo que la cremallera de leucinas de CEP2 es necesaria pero no suficiente para que se diera la interacción con c-Fos. Realizamos mutagénesis de una o varias leucinas de dicho motivo, testando la importancia de las leucinas en esta interacción, observándose que la mutagénesis de una, dos o tres leucinas interrumpía la interacción. Así, aunque la cremallera de leucinas de CEP2 no es suficiente para la interacción con c-Fos, la integridad de dicho dominio parece esencial para esta interacción. Este motivo en cremallera de leucinas se ha descrito como el motivo de dimerización de la familia AP-1. El siguiente paso fue testar si la interacción se producía entre las dos proteínas humanas en un ensayo de arrastre con GST y GST-CNAP1 donde se usaron extractos celulares que contenían c-Fos endógena y sobrexpresada. Estos ensayos también mostraron que se producía la interacción en humanos y confirmaba la relevancia de las leucinas de C-NAP1 en la interacción ya que la mutación en una de las leucinas del dominio en cremalleras de leucinas de C-NAP1 era suficiente para que se interrumpiese la interacción. Ensayos de coinmunoprecipitación de extractos de células humanas nos indicaron que esta interacción se daba en células humanas. Las imágenes de microscopía de la doble inmunofluorescencia c-Fos/C-NAP1 y el aislamiento de centrosomas y posterior análisis por western blot permitió demostrar que una fracción de c-Fos estaba asociada al centrosoma. La presencia de c-Fos en estas fracciones podría indicar una función de c-Fos en el centrosoma. De hecho, otros factores de transcripción que se localizan en el centrosoma, tales como p53, pRb o BRCA1 están implicados en la regulación de la duplicación del centrosoma. El papel de c-Fos en el centrosoma podría ser a través de C-NAP1 ya que hemos observado en estudios de inmunofluorescencia de células humanas donde se sobrexpresaba c-Fos una disminución de C-NAP1 endógeno en el centrosoma. Este efecto parece ser específico sobre C-NAP1 ya que la sobreexpresión de c-Fos no disminuía la cantidad de otra proteína centrosomal como es la gamma-tubulina. Por otro lado la expresión de otra proteína diferente, JNK (c-Jun N-teminal Kinase), no tenía ningún efecto sobre C-NAP1 mostrando la especificidad del efecto de c-Fos sobre C-NAP1. El efecto de c-Fos sobre C-NAP-1 podría explicarse por un secuestro/arrastre de C-NAP1 por c-Fos hacia el citoplasma o al núcleo. Por otro lado, en ensayos EMSA con extracto total celular incubado con GST-C-NAP1 procedente de células NIH-3T3 ayunadas+estimuladas se incrementaba la actividad AP-1 en comparación con la incubación del control GST. Se han descrito casos similares, como por ejemplo el de la proteína centrosomal CEP290 que modula la actividad del factor de transcripción ATF4 en el núcleo. Así, también podría se C-NAP1 la que regulase la actividad transcripcional de c-Fos en el núcleo.