Estudio de la expresión de marcadores de transición epitelio-mesenquimal y de célula madre cancerosa en el melanoma cutáneo, y su asociación con la progresión tumoral

Resumen

La mayoría de los estudios epidemiológicos muestran un aumento en la incidencia de melanoma en las últimas décadas, sobre todo a expensas de un aumento en la incidencia de melanomas delgados. La búsqueda de nuevos marcadores pronósticos y predictivos incluye el estudio de el fenómeno de transición epitelio-mesenquimal (EMT) que consiste en un proceso dinámico por el que las células adquieren progresivamente un fenotipo mesenquimal, con pérdida de las uniones célula-célula, modificaciones en el citoesqueleto y adquisición de marcadores como cadherina-N, osteonectina/SPARC, osteopontina, fibronectina, Twist y Snail. Por otro lado, en el modelo de tumorigénesis de la célula madre cancerosa (CMC), únicamente las células madre cancerosas, que expresan marcadores como ABCB5, ABCG2, CD34 y CD133, serían capaces de formar tumores, heterogéneos en su composición. En este trabajo de tesis doctoral planteamos la hipótesis de que tanto los marcadores de EMT como de CMC estarían implicados en la progresión tumoral del melanoma cutáneo, y podrían constituir marcadores evolutivos o factores predictivos de la misma. En base a esto, se realizó un estudio con una parte clínica, que incluyó 132 muestras de tumores procedentes de pacientes de el hospital Clínico universitario de Valencia, de las cuales 70 eran tumors primarios (31 delgados y 39 gruesos), y 62 metástasis (18 en tránsito, 27 en ganglios regionales y 17 a distancia) donde se analizó la expresión de los marcadores de interés mediante dos técnicas, la RT-PCR en tiempo real, y la inmunohistoquímica; y una parte experimental, donde se caracterizaron varias líneas celulares y sus xenotrasplantes en ratones inmunodeficientes nude, mediante citometría de flujo. Además, en las muestras de tumores humanos de secuenciaron los genes BRAF y NRAS para determinar la presencia de mutaciones. Se correlacionaron los resultados obtenidos con los factores clinicopatológicos,y con el estado mutacional de BRAF y NRAS. Además, se estudiaron las posibles diferencias en la expresión de los marcadores de interés en las distintas fases de progresión del melanoma, y se correlacionaron con el desarrollo de metástasis, con el intervalo libre de las mismas y con la supervivencia, para proponer modelos predictivos. Los resultados obtenidos permiten concluir que: En el estudio experimental, las líneas de melanoma humano son capaces de inducir el crecimiento tumoral y crear tumores heterogéneos respecto a la expresión de CD133 y otros marcadores de célula madre y EMT, con independencia de la expresión o no de este marcador en las células xenotransplantadas, aunque se observa una mayor velocidad de crecimiento en las células inicialmente CD133+. Una mayor expresión inmunohistoquímica de cadherina-N y osteonectina/SPARC y un aumento de expresión de ARN mensajero de fibronectina, osteonectina/SPARC y osteopontina son características de la fase de crecimiento vertical. La expresión de ARN mensajero de osteopontina (SPP1), cadherina-N (CDH2), FN1, SNAIL-1, SNAIL-2, ON/SPARC, ABCG2 y PROM-1 (CD133) muestra una correlación positiva con el índice de Breslow, mientras que en el estudio inmunohistoquímico sólo la osteopontina y la tinción nuclear para CD34 presentan esta correlación. Por el contrario, la expresión de ARN mensajero de CD34 tiene una correlación negativa con el índice de Breslow. La presencia de ulceración se correlaciona con la expresión inmunohistoquímica de osteonectina/SPARC, fibronectina y CD34 nuclear, y con un mayor nivel de ARN mensajero de ON/SPARC, OP, FN, CDH2, ABCB5, y tiene una correlación negativa con el ARN mensajero de CD34. En cuanto al estudio mutacional, una mayor inmunotinción citoplasmática de ABCB5, ON, OP, y FN se correlaciona con mutaciones en BRAF. En las metástasis está sobreexpresado el ARN mensajero de ABCB5, Cadherina-N, ON/SPARC, OP, FN1, en comparación con los melanomas primarios. Sin embargo, estas diferencias desaparecen cuando se valora exclusivamente la inmunotinción en células tumorales, excepto para CD34 nuclear. El desarrollo de metástasis ganglionares y a distancia se correlaciona con la sobreexpresión de ARNm de FN1, OP(SPP1), ON/SPARC, ABCB5 y ABCG2. Dicha correlación se observa también inmunohistoquímicamente para osteopontina, osteonectina/SPARC, CD133 y CD34 nuclear. El tiempo de supervivencia se ve reducido en los pacientes con una inmunotinción generalizada para ON/SPARC y CD133 en el melanoma primario. La expresión de ARN mensajero de ABCG2, la inmunotinción nuclear para CD34, aunque sea focal, y la inmunotinción generalizada para ON/SPARC en las células tumorales del melanoma primario se asocian a un acortamiento del intervalo libre de metástasis a distancia. La inmunotinción para CD133 en las células tumorales del melanoma primario se correlaciona positivamente con una mayor capacidad metastásica, y particularmente cuando la tinción es intensa. El estudio de esta variable incrementa además el valor predictivo de los parámetros clásicos (índice de Breslow y ulceración).