Caracterización bioquímica y funcional de MnmC, una proteína modificadora de tRNA de Escherichia coli

Zusammenfassung

En esta tesis doctoral se ha pretendido conocer aspectos bioquímicos y funcionales de la proteína bifuncional MnmC, modificadora de la U34 en algunos tRNAs del organismo Escherichia coli siempre teniendo en cuenta el marco de la ruta donde actúa (Ruta MnmEG). El primer objetivo fue clonar y expresar cada dominio de MnmC por separado para tener un sistema de estudio de las reacciones que ejercen por separado. Uno de los objetivos más importantes ha sido determinar cómo algunos de los tRNA sustratos de la ruta MnmEG son modificados por la enzima MnmC mediante un estudio comparativo de los dos dominios de la proteína y utilizando técnicas bioquímicas, genéticas y microbiólogicas para obtener datos in vitro e in vivo. Se han incluido estudios cinéticos de cada dominio y de unión de tRNA sustratos y no sustratos a cada dominio para localizar posibles diferencias entre ellos. Además, se ha realizado un estudio mutacional de residuos posiblemente implicados en la unión a los sustratos de MnmC (SAM, FAD y tRNA) y aquellos que podrían participar en las reacciones de modificación llevadas a cabo en cada dominio para obtener información in vivo de cómo transcurren las reacciones en MnmC. Por último, se ha pretendido estudiar la función que ejerce MnmC en E.coli mediante el estudio de rasgos fenotípicos (crecimiento, competición) en cepas deficientes en la actividad de MnmC y otras implicadas o relacionadas con la ruta MnmEG. La adaptación de MnmEG para usar amonio o glicina, junto con la adquisición de las actividades de MnmC proporcionan a E. coli una ventaja al sintetizar mnm5s2U para afrontar diferentes condiciones de estrés.