Estudio de los efectos del azt sobre la médula ósea y el riñón en ratonesprevención con vitaminas c y e

Resumen

ESTUDIO DE LOS EFECTOS DEL AZT SOBRE LA MÉDULA ÓSEA Y EL RIÑÓN EN RATONES: PREVENCIÓN CON VITAMINAS C Y E. INTRODUCCIÓN La zidovudina o AZT ha sido el primer antirretroviral utilizado frente al VIH. Aunque se sintetizó en 1964 y se utilizó con escaso éxito en el tratamiento de leucemias, su actividad antirretroviral se descubrió en 1995. El AZT (3¿-azido-2¿3¿-didesoxitimidina) es un análogo del desoxinucleósido de timidina. Forma parte del grupo de fármacos inhibidores de transcriptasa inversa análogos de nucleósidos (ITIAN). Su trifosforilación en el citoplasma por medio de la timidín-quinasa celular convierte al AZT en un inhibidor competitivo del trifosfato de timidina (TTP) natural. Así, cuando la transcriptasa inversa del virus VIH incorpora AZT trifosfato en lugar de TTP, queda bloqueado el proceso de elongación de la cadena de ADNc a partir de ADN viral. Su acción antivírica la ejerce fundamentalmente a nivel de linfocitos T activados y, en menor grado, en los monocitos y macrófagos infectados. Entre los efectos adversos del AZT cabe destacar la lipodistrofia, la miopatía, la cardiotoxicidad, la acidosis láctica y, a corto plazo, la toxicidad sobre la médula ósea, lo que condiciona la aparición de anemia y/o neutropenia, probablemente por reducir la actividad de las mitocondrias en las células progenitoras. En 1995, Lewis y Dalakas enunciaron la hipótesis de la polimerasa-¿, basada en considerar los efectos tóxicos del AZT y del resto de ITIAN como consecuencia directa de la inhibición selectiva de la polimerasa-¿ y la depleción de ADNmt. El AZT produce estrés oxidativo. Los antioxidantes elegidos para la realización del presente trabajo han sido las vitaminas C y E, con el propósito de poseer un sistema antioxidante con dos componentes, uno hidrofílico y otro lipofílico. Las dosis utilizadas de vitamina C fueron de 1,25 g/Kg peso corporal y vitamina E, 75 mg/Kg peso corporal, teniendo en cuenta que debían ser lo suficientemente elevadas como para obtener un efecto antioxidante. EL OBJETIVO GENERAL de la tesis ha sido comprobar si el tratamiento con AZT induce daño oxidativo mitocondrial medular y renal in vivo y si el uso de las vitaminas antioxidantes C y E de demostrada eficacia, eran capaces de prevenir este daño mitocondrial. MATERIALES Y MÉTODOS Se han utilizado ratones machos, cepa OF-1, de 5 meses de edad cuando fueron sacrificados. La duración del estudio ha sido de 40 días, excepto en animales pretratados, que fué de 70 días. El AZT se administró a dosis terapéuticas de 10 mg/Kg peso corporal/día administrado en el agua de bebida. El trabajo consta de dos partes bien diferenciadas: la primera, en la que se han efectuado estudios en sangre periférica y en médula ósea, con tres grupos de ratones (grupo control, grupo AZT 10 mg, grupo AZT 10 mg+Vit) y un cuarto grupo (AZT 10 mg+Vit Pretratados ) que se adicionó posteriormente. Para la segunda parte del trabajo, los estudios en suero, orina y riñón, con cinco grupos de ratones diferentes (control, AZT 10 mg, AZT 100 mg, AZT 10 mg+Vit, AZT 100 mg+Vit) con objeto de comprobar si las posibles alteraciones en el metabolismo y la función renal, eran dependientes de la dosis. Se ha determinado GSH y GSSG en sangre y MDA en plasma; los posibles cambios en el estado nutricional y metabólico, se han determinado midiendo glucosa en suero y en orina. Las posibles alteraciones en el metabolismo nitrogenado, midiendo urea y 23 aminoácidos en suero y en orina. La función renal, mediante la creatinina en suero y orina y el aclaramiento de creatinina. Por citometría de flujo se han medido: nºde leucocitos y nº de células en médula ósea, y determinación de peróxidos en riñón y médula ósea. RESULTADOS 1. Estudios en sangre periférica y médula ósea. El AZT produce leucopenia en ratones, con un descenso significativo, superior al 35% en el recuento de leucocitos en sangre periférica. Este descenso es prevenido completamente cuando en la dieta de los ratones se adicionan las vitaminas C y E. Se midieron marcadores de estrés oxidativo. El AZT produce un aumento de los niveles de GSSG en sangre (no significativo). Al añadir las vitaminas antioxidantes los valores de GSSG recuperaron cifras similares a los valores controles. Los valores de MDA como representantes del aumento del grado de peroxidación lipídica sufrieron un incremento estadísticamente significativo en el grupo tratado con AZT 10 mg; al añadir las vitaminas C y E, los valores descendieron significativamente por debajo de los valores controles. Para la medida de la celularidad de la médula ósea utilizamos el cuarto grupo de ratones pretratados 30 días antes de administrar el AZT , con vitaminas C y E a dosis supranutricionales junto con la dieta de mantenimiento estándar. Así, el AZT produce un descenso en el número de células de la médula ósea significativo en el grupo tratado sólo con AZT. Sin embargo, la adición de las vitaminas C y E en la dieta previene este descenso especialmente en el grupo de ratones pretratado. Cuando las vitaminas se administran simultáneamente con el AZT sin pretratamiento, sólo una ligera y no significativa mejora de la celularidad de la médula ósea ha sido observada. Se midieron peróxidos en las mitocondrias de la médula ósea. El AZT produjo un incremento en la producción de peróxidos que es disminuído significativamente por la adición de las vitaminas antioxidantes. Los efectos beneficiosos de las vitaminas C y E parecen ser debidos a su capacidad antioxidante, pudiendo estar implicados en la estimulación de la proliferación de precursores mieloides de la médula ósea. 2. Estudios en suero, orina y riñón. Excepto para el grupo AZT 100 mg, el resto de grupos experimentales presenta glicosuria con respecto al grupo de ratones control. La excreción de urea sólo se encuentra aumentada significativamente en el grupo tratado con AZT 100 mg+Vit C y E. Los 23 aminoácidos medidos se encuentran en concentraciones superiores en orina de ratones tratados con respecto al control, siendo la combinación AZT a dosis de 100 mg y vitaminas C y E la que produce aminoaciduria significativa. El 40% de la población mitocondrial tiene tamaño grande, lo cual está asociado al swelling, es decir, a una mayor pérdida de la arquitectura interna y ruptura de crestas de la población mitocondrial estudiada por citometría de flujo. Al tratar con AZT, este porcentaje aumenta proporcionalmente al aumento de dosis del fármaco de forma estadísticamente significativa; sin embargo, el tamaño de esta población se reduce notablemente, con diferencias estadísticamente significativas cuando añadimos al tratamiento, las vitaminas C y E. Estos resultados se han podido confirmar con el estudio por ultramicroscopía electrónica y óptica en el Departamento de Patología de la Facultad de Medicina de Valencia. CONCLUSIONES 1. El tratamiento de ratones con AZT causa una disminución importante en la celularidad de la médula ósea y leucopenia. Ambos efectos pueden ser prevenidos mediante la administración de dosis supranutricionales de vitaminas C y E. 2. Los efectos beneficiosos de las vitaminas antioxidantes C y E sobre la médula ósea, pueden explicar nuevos mecanismos relacionados con la proliferación de precursores mieloides en la médula ósea. 3. Los resultados obtenidos en el presente trabajo establecen las bases bioquímicas para proponer el suplemento en la dieta con vitaminas C y E, con el fin de prevenir la leucopenia inducida por el AZT. 4. La glicosuria y aminoaciduria encontradas resultan compatibles con la hipótesis de la existencia de una alteración localizada en el túbulo contorneado proximal, siendo la combinación de AZT a dosis altas y vitaminas C y E la que produce glicosuria y aminoaciduria significativas. 5. El daño mitocondrial encontrado en el estudio de microscopía electrónica y óptica de las muestras renales corrobora la alteración localizada en el túbulo proximal, apuntando al grupo tratado con AZT 100 mg y vitaminas C y E como causante de la mayor degeneración microvacuolada tubular.