Cultivos transgénicos de bacillus thuringiensisaparición de resistencia en insectos plaga y efecto sobre fauna auxiliar

Resumen

En esta tesis se ha estudiado la naturaleza de la resistencia a las proteínas Cry en distintas colonias de insectos plaga de invernadero y de laboratorio. El objetivo principal es entender los mecanismos subyacentes a la resistencia. Esto es de gran importancia para poder desarrollar nuevas estrategias que retrasen la aparición de resistencia en campo o implementar las ya existentes. Se ha tratado del mismo modo de desarrollar nuevas técnicas (inmunodetección in vivo, preservación de receptores por liofilización) y poner a punto en nuestro laboratorio otras técnicas ya existentes (formación de poro) aplicadas al estudio del mecanismo de acción de las proteínas Cry de B. thuringiensis. El conocimiento del mecanismo de acción de estas proteínas es requisito indispensable para estudiar su toxicidad en organismos beneficiosos así como para establecer las causas de la resistencia en insectos plaga. Finalmente, se ha abordado de forma rigurosa el estudio del posible efecto negativo de los cultivos-Bt en Chrysoperla carnea. Este es un tema controvertido que diversos grupos han estudiado desde los años 90 y que, con nuestra aproximación multidisciplinar, ha quedado definitivamente cerrado. A continuación se resumen únicamente los experimentos y resultados obtenidos en esta tesis, sin embargo hay que tener en cuenta que forman parte de estudios en colaboración con otros grupos y que en las publicaciones adjuntas se proporcionan más datos que enriquecen la discusión y podrían favorecer comprensión de los resultados presentados a continuación. I.- Desarrollo de un nuevo método de preservación de receptores de las proteínas Cry La alteración de la unión de las proteínas Cry a receptores específicos en el intestino de los insectos es el mecanismo de resistencia más común y mejor caracterizado. Por tanto, el conocimiento de las interacciones proteína-receptor es de crucial importancia para el diseño apropiado de estrategias de prevención de resistencia cruzada. El procedimiento habitual para estos estudios es la preparación de BBMV (vesículas de membrana intestinal de borde en cepillo) de intestinos de larvas frescas o congeladas. El envío de insectos plaga vivos entre laboratorios en el mundo supone un gran riesgo medioambiental por lo que durante mucho tiempo la forma habitual de transporte ha sido en hielo seco conllevando restricciones aduaneras y frecuentes perdidas de material, en ocasiones irreemplazable. Por este motivo nos planteamos como objetivo el desarrollo de un nuevo método de preservación de receptores de las proteínas Cry. Los resultados mostraron que los receptores de la membrana epitelial de borde en cepillo del intestino de los insectos analizados (Manduca sexta, Spodoptera exigua y Helicoverpa armigera) mantienen su capacidad de unión a Cry1Ab después de haber sido liofilizados y transportados en hielo. Las muestras liofilizadas mostraron además un mayor rendimiento (mg BBMV/g intestino) respecto a sus correspondientes congeladas. Mientras que las BBMV obtenidas a partir de material liofilizado mostraron parámetros de unión y actividad enzimática de marcadores de membrana con valores semejantes a los de los controles congelados. Posteriores experimentos no incluidos en esta tesis han ampliado los resultados de este estudio demostrando que es posible realizar experimentos de unión in vitro de otras proteínas Cry1 a BBMV procedentes de intestinos liofilizados o de larvas completas liofilizadas que fueron, en ambos casos, transportados a temperatura ambiente. II.- Caracterización los mecanismos de resistencia a las proteínas Cry en colonias de insectos plaga. El objetivo de estos estudios fue caracterizar la resistencia en diversas colonias de insectos. Resultaba de gran interés poder comparar distintas especies de insectos plaga que a su vez habían sido seleccionados para la resistencia de las proteínas Cry mediante diferentes métodos. Los insectos fueron proporcionados por los grupos colaboradores y en el caso de O. nubilalis, los intestinos fueron transportados a temperatura ambiente tras ser liofilizados. Posteriormente, las muestras fueron analizadas en nuestro laboratorio. Las colonias de insectos plaga resistentes a las proteínas Cry que han sido analizadas en esta tesis incluyen: Trichoplusia ni; plaga generalista de cultivos de invernadero. Segunda especie que ha desarrollado resistencia de forma natural, es decir, fuera de laboratorio. El resultado de los experimentos de unión in vitro de las proteínas Cry1 Ac y Cry1Ab a BBMV de intestinos de estos insectos confirmó que la resistencia a Cry1Ac en GLEN-Cry1Ac-BCS es debida a la reducción de la unión de esta proteína a los receptores del intestino. Estudios previos habían establecido un sitio de unión de alta afinidad común para Cry1Ac y Cry1Ab en T. ni susceptible. A este sitio de unión también se supone la unión de baja afinidad de otras proteínas como Cry1Aa y Cry1F (Estada y Ferré., 1994; Iracheta et al., 2000). Nuestros resultados nos llevan a proponer como mecanismo responsable de la resistencia la alteración de este sitio de unión común de alta afinidad anteriormente descrito. Las larvas F1 procedentes del cruzamiento entre insectos resistentes y sensibles fueron también analizadas. Tal y como cabía esperar, estos insectos mostraron susceptibilidad a Cry1 Ac y se mantuvo en ellos la unión de esta toxina en el epitelio intestinal. Por tanto se demuestra que la herencia de la resistencia es también recesiva a nivel bioquímico y apoya los resultados fenotípicos obtenidos por Janmaat et al. (2003). Los receptores propuestos para las proteínas Cry1A incluyen aminopeptidasa-N (APN), cadherina, fosfatasa alcalina (m-ALP) y glicolípidos. En nuestro estudio se establece la alteración de la unión de Cryl1c/CryAb como principal mecanismo de resistencia, sin embargo será necesario seguir investigando sobre la naturaleza del receptor responsable de la resistencia en este insecto. Ostrinia nubilalis; plaga del maíz. Colonia resistente de laboratorio. Nuestros resultados en la colonia SKY de O. nubilalis muestran una ligera variación en parámetros de unión. La concentración de receptores para Cry1Ab y Cry1Aa se mantuvo invariable entre insectos susceptibles y resistentes. Por otro lado, la afinidad de la proteína Cry1Aa se vio reducida 5.6 veces en insectos resistentes, sin verse afectado este parámetro en el resto de proteínas analizadas. La variación observada a nivel de afinidad y concentración de receptores en Cry1Ac no se considera significativa ya que es debida a la variabilidad en el cálculo de la actividad específica de la proteína Cry1Ac marcada radiactivamente. La resistencia en esta colonia de O. nubilalis ha sido asociada a la cadherina como receptor responsable mediante experimentos de ligand blot (Siquiera et al., comunicación personal). En cualquier caso, el mecanismo de resistencia parece ser un proceso complejo en el que están implicadas moléculas de diferente naturaleza. Por este motivo nos planteamos la necesidad de diseccionar el mecanismo de acción de las proteínas Cry lo más detalladamente posible ya que cada paso de este mecanismo es una potencial diana para la resistencia. Hemos observado que en estos casos, nuestros experimentos de unión in vitro no resultan una herramienta suficientemente precisa para cuantificar las alteraciones de la unión de las proteínas Cry. El motivo de esta falta de precisión podría ser que la cadherina constituye una baja proporción de las moléculas a las que se unen las proteínas in vitro. Podríamos decir que la unión "efectiva" se ve enmascarada por otro tipo de uniones "contaminantes". Otra posibilidad es que se trate de una alteración del mecanismo de acción posterior a la unión. En este caso el proceso de formación de poro se vería alterado sin haber diferencias aparentes en la unión de las proteínas. Para estudiar esta posibilidad se puso a punto el método de formación de poro (Bloque III) Helicoverpa zea; plaga del algodón. Dos colonias resistentes de laboratorio denominadas MR y AR. Los resultados obtenidos en H. zea indican que en este insecto hay un mecanismo subyacente de resistencia diferente a los descritos para otros insectos plaga en esta tesis. Este mecanismo no conlleva la pérdida o reducción de la unión a un receptor, como fue el caso de T. ni (Bloque II, Apartado 4) ni tampoco el descenso de afinidad para las proteínas Cry1A como se encontró en O. nubilalis. (Bloque II, Apartado 5). Se trata pues de un mecanismo en el que aparentemente la unión de las proteínas Cry a los receptores intestinales no se ve afectada. Alternativamente a la unión, podría ser responsable de la resistencia una alteración en alguno de los pasos del mecanismo post-unión. Por este motivo se decidió poner a punto el método de formación de poro en el laboratorio. Se planteó la necesidad de analizar si la alteración de este mecanismo era responsable de la resistencia en la colonia resistente de H. zea (AR). El hecho de que en H. zea la unión in vitro de las proteínas Cry a BBMV no esté en concordancia con la resistencia mostrada por el insecto, nos ha llevado a plantear la posibilidad de que en este caso, la unión reflejada en nuestros experimentos sea una mezcla de unión fútil y de unión efectiva. Por un lado, la unión fútil puede enmascarar aquella alteración de la unión que refleja la resistencia cuando el número de receptores efectivos implicados en este proceso es proporcionalmente menor. Por último, hay que recordar que O. nubilalis y H. zea son colonias de insectos seleccionadas en laboratorio. Las condiciones de selección, por tanto, no son las existentes en campo y podría ocurrir que den lugar a mecanismos de resistencia que no aparecen en condiciones naturales. Debido a la falta de insectos resistentes de campo, el análisis de colonias resistentes de laboratorio resulta la herramienta más útil, pero debemos tener en cuenta sus limitaciones. Por otro lado, la técnica de la unión in vitro ha resultado de gran utilidad para caracterizar la resistencia de los dos lepidópteros P. xylostella y T. ni (Bloque II, Apartado I) que han desarrollado resistencia en campo e invernadero, respectivamente. III.- Análisis del mecanismo de unión y formación de poro de la proteína Cry1Ac en distintas partes del intestino de larvas de los lepidópteros Manduca sexta y Helicoverpa armigera. El objetivo principal de este estudio fue poner a punto la técnica en el laboratorio para poder aplicarla con posterioridad a la caracterización de la resistencia en aquellos casos en los cuales los experimentos de unión in vitro no proporcionaban suficiente información. Se planteó como primera aproximación, un estudio comparativo de la unión in vitro y de la formación de poro inducida por la proteína Cry1Ac en las distintas zonas del intestino medio de insectos susceptibles. El primer objetivo de este trabajo fue analizar en paralelo la unión de la proteína Cry1Ac así como su capacidad de formar poro en la zona inicial y final del intestino medio de H. armigera y M. sexta. Con el fraccionamiento del intestino se pretendía enriquecer la muestra en el receptor de Cry1Ac (localizado principalmente en la zona final). Al mismo tiempo, como segundo objetivo, se trataba de establecer un sistema que permitiera discriminar la posible unión fútil de Cry1Ac de la unión efectiva en insectos susceptibles. La comparación de los métodos de unión in vitro y de formación de poro debía darnos una idea sobre cuál de ellos es el más apropiado para el estudio del mecanismo de resistencia de H. zea. El tercer y último objetivo consistía en determinar si la toxicidad de Cry1Ac en insectos susceptibles depende de la unión a APN o m-ALP a través del residuo de GalNAc o si por el contrario, se trata de una unión fútil. Se trató de establecer si existen más receptores o epítopos del mismo receptor, mediante los cuales la proteína Cry1Ac es capaz de ejercer su toxicidad provocando la formación de poro en las membranas. Como resultado mostrado de los experimentos realizados, se observó que Cry1Ac tiene capacidad de formar poro tanto en la zona inicial como en la zona final del intestino medio de H. armigera y de M. sexta. Se observó además una mayor formación de poro inducida por Cry1Ac en la zona final respecto a la zona inicial del intestino de ambos insectos. No se encontraron diferencias significativas en los parámetros de unión in vitro de Cry1Ac cuando fueron analizados separadamente en ambas zonas del intestino medio de H. armigera y de M. sexta. Estos resultados confirman la hipótesis de que en los ensayos de unión in vitro existe una parte de unión que no resulta efectiva a nivel de formación de poros. Sin embargo, no se puede descartar que estas uniones no sean importantes a nivel de otros mecanismos como cascadas de señalización intracelular relacionadas con el mecanismo de toxicidad. Se demuestra que la cuantificación de las proteínas marcadas radiactivamente unidas a las BBMV es la suma de la unión a diversas moléculas. Generalmente se trata en su mayor parte de una unión específica, pero no necesariamente responsable de forma directa de la formación de poro. Cuando Cry1Ac fue preincubada con el azúcar GalNAc se observó una completa inhibición de la formación de poro en ambas zonas del intestino medio de H. armigera y únicamente en la zona final del intestino medio de M. sexta. Se concluye que toda la unión efectiva, capaz de formar poro se realiza, en estos casos, a través de un residuo de GalNAc del receptor. Receptores candidatos que poseen residuos de GalNAc son la APN y la m-ALP. En la zona inicial del intestino medio de M. sexta se observó una inhibición parcial de la formación de poro cuando la proteína Cry1Ac fue preincubada con GalNAc. Se confirma, en esta zona del intestino, la existencia de un mecanismo de formación de poro independiente de la unión mediante el residuo de GalNAc. Este mecanismo podría ser el responsable de la mayor toxicidad de la proteína Cry1Ac para M. sexta en comparación con H. armigera. Los experimentos de unión in vitro en presencia de GalNAc mostraron como máximo una inhibición del 68% de la unión de Cry1Ac (zona final del intestino medio de H. armigera). Es decir, el 32% de esta unión sería no mediada por GalNAc correspondiendo a la unión no formadora de poro que sin embargo, es contabilizada como "receptor" en los experimentos de unión in vitro. Explicaría al mismo tiempo porqué, en ocasiones, se detecta unión aún cuando las proteínas no muestran toxicidad para el insecto. Se concluye además, que el método de unión in vitro es un método óptimo para realizar caracterización de la resistencia en aquellos insectos en los cuales la unión de la proteína al receptor se ve dramáticamente alterada. Pero no es un método óptimo para predecir toxicidad de las proteínas Cry en insectos susceptibles. Por el contrario, el método de formación de poro parece correlacionar con la toxicidad de la proteína Cry1Ac tanto en H. armigera como en M. sexta. IV- Efecto de la proteína Cry1Ac en Chrysoperla carnea: una aproximación microscópica. El objetivo de este trabajo fue desarrollar una nueva aproximación metodológica que ayudara a esclarecer la controversia sobre los efectos de los cultivos-Bt en la fauna auxiliar y en especial en C. carnea. Se consideró adecuado desarrollar una aproximación microscópica para este estudio ya que la unión específica de las proteínas Cry1 a la membrana epitelial en borde en cepillo del intestino del insecto es un paso necesario para la existencia de toxicidad. Si dichas proteínas son tóxicas para C. carnea debemos encontrarlas unidas en el intestino de este insecto del mismo modo que las encontramos en insectos susceptibles. Los resultados mostraron que la técnica de inmunodetección de la proteína Cry1Ac después de haber sido ingerida (unión in vivo) permitió localizar la proteína unida a la membrana peritrófica y al epitelio intestinal de las larvas de H. armigera, para las cuales es conocida su toxicidad. Por el contrario, no se detectó la proteína en el intestino de C. carnea. Mediante tinciones diferenciales se observó alteración de las estructuras celulares y del epitelio intestinal en H. armigera mientras que estas estructuras permanecieron inalteradas en C. carnea. Se concluye que no hay evidencias para considerar la proteína Cry1Ac tóxica para C. carnea. Publicaciones resultantes: C.S Hernández, Ana Rodrigo and Juan Ferré. 2004. "Lyophilization of lepidopteran midguts: a preserving method for Bt toxin binding studies".Journal of Invertebrate Pathology. 85: 182-187. Rodrigo-Simón A, de Maagd RA, Avilla C, Bakker PL, Molthoff J.González- Zamora JE, Ferré J.2005. "Lack of detrimental effeets of Bacillus thuringiensis Cry toxins on the insect predator Chrysoperla carnea: a toxicological, histopathological, and biochemical analysis". Applied and Environmental Microbiology. 72(2): 1595-603. Wang, P., Zhao, J. Z., Rodrigo-Simón, A., Kain, W., Janmaat, A. F., Shelton, A. M., Ferré, J., Myers, J. 2007. Mechanism of resistance to Bacillus thuringiensis toxin Cry1Ac in a greenhouse population of cabbage looper, Trichoplusia ni. Appl. Environ. Microbiol. 73: 1199-1207. Anilkumar, J. K., Rodrigo-Simón, A., Ferré, J., Pusztai-Carey, M., Sivasupramaniam, S., Moar, W. J. 2008. Production and characterization of Bacillus thuringiensis Cry1Ac- resistant cotton bollworm Helicoverpa zea (Boddie). Appl. Environ. Microbiol. 74(2): 462-469. Rodrigo-Simón, A., Caccia, S., Ferré, J. 2008. Bacillus thuringiensis Cry1Ac toxin binding and pore-forming in brush border membrane vesicles prepared form anterior and posterior midgut regions of lepidopteran larvae. Appl. Environ. Microbiol. 74(6): 1710-1716.