Perfil de micro arns exosomales asociados a daño glomerular en pacientes hipertensos con microalbuminuria

Resumen

Introducción: La hipertensión arterial esencial (HTA) es la enfermedad crónica con mayor prevalencia a nivel mundial y constituye uno de los factores de riesgo cardiovascular primario. Pese al control de la presión arterial con antihipertensivos, la aparición de daño renal en la HTA es frecuente y se mide clínicamente como un aumento en la excreción urinaria de albúmina (EUA). Este daño incipiente se define como microalbuminuria, puede progresar a macroalbuminuria y proteinuria durante el curso de la enfermedad y se utiliza como marcador de riesgo cardiovascular y daño orgánico en la hipertensión. Recientemente, las vesículas extracelulares (VE) han sido propuestas como nuevos mediadores de la comunicación intercelular, capaces de transportar ácidos nucleicos, proteínas y lípidos. Los exosomas han sido el tipo de VE más estudiado y su capacidad para transportar micro ARNs (miARNs) de forma selectiva entre células los convierte en candidatos ideales para la identificación de nuevos marcadores y/o mecanismos de lesión. Los miARNs son pequeñas moléculas de ARN no codificante para proteínas que regulan la expresión génica, son muy estables en la circulación y presentan alta especificidad celular y tisular. En el riñón, los miARNs son indispensables para su desarrollo y el mantenimiento de la barrera de filtración. Además, cambios en el perfil de miARNs en diversos biofluidos han sido propuestos como marcadores de inicio y progresión de enfermedad renal. Hipótesis y Objetivos: La hipótesis de trabajo es que los miARNs de exosomas de orina y plasma pueden estar regulando procesos biológicos clave en la aparición y desarrollo de microalbuminuria en la HTA. Por ello, los principales objetivos de esta tesis han sido: a) aislar, cuantificar y caracterizar distintos tipos de VE en orina y plasma; b) identificar un perfil de miARNs en exosomas de plasma y orina asociados a la presencia de microalbuminuria y determinar los procesos biológicos en los que participan; y c) validar miARNs del perfil asociado a microalbuminuria que puedan ser utilizados como biomarcadores diagnóstico y pronóstico de daño renal incipiente en la HTA. Material y métodos: Se ha utilizado una cohorte de 52 pacientes con HTA, 28 normoalbuminúricos y 24 microalbuminúricos (MALB). A partir de plasma y orina de cada paciente se aislaron las VE mediante ultracentrifugación, se caracterizaron por tamaño y composición proteica y se procedió a la extracción del ARN total. A continuación, se generaron librerías individuales de ARNs pequeños para secuenciación masiva (NGS) y se analizó la expresión diferencial de miARNs entre los dos grupos de estudio. Posteriormente, se llevó a cabo un análisis de enriquecimiento para identificar los procesos biológicos más regulados por los miARNs que presentaban niveles diferenciados entre grupos y se contrastaron con la base de datos de KEGG. Por último, varios miARNs del perfil se validaron por RT-qPCR. Resultados: Los resultados obtenidos confirman una correcta separación de VE en orina y plasma, obteniéndose dos poblaciones (exosomas y microvesículas) bien diferenciadas en cuanto a tamaño y composición proteica. Además, se ha demostrado un enriquecimiento de ARNs pequeños en las VE y cómo la presencia de microalbuminuria puede condicionar el perfil de miARNs exosomales. Por su parte, los resultados obtenidos en la secuenciación muestran un perfil de 29 miARNs exosomales cuyos niveles están asociados a la microalbuminuria y que regula un total de 25 procesos biológicos. Entre los más regulados se encontraban el citoesqueleto de actina, diversas vías de señalización celular (calcio, MAPK, p53), factores de crecimiento como TGF-β y VEGF, uniones célula-célula (adherentes, focales y estrechas), así como moléculas de adhesión e interacción con la matriz extracelular. Por último, los niveles de miR-26a-5p en exosomas de orina disminuyeron en el grupo MALB y mostraron una correlación inversa con la EUA. Conclusiones: Se ha establecido un perfil de 29 miARNs exosomales con niveles alterados en pacientes hipertensos con microalbuminuria que regula numerosos procesos biológicos que pueden desencadenar el inicio y la progresión del daño glomerular, afectando a vías de señalización clave en podocitos, células endoteliales y mesangiales. Además, se ha validado un descenso en los niveles de miR-26a-5p en exosomas de orina del grupo MALB. Este miARN regula vías de señalización y factores de crecimiento fundamentales en el desarrollo y mantenimiento de la barrera de filtración glomerular como TGF-β y VEGF, por lo que se convierte en un potencial biomarcador diagnóstico y pronóstico de lesión glomerular en la HTA. En su conjunto, los resultados de esta tesis demuestran el interés del estudio de micro ARNs transportados por exosomas de orina y plasma para entender los mecanismos de lesión implicados en el desarrollo de daño orgánico durante el curso de la HTA.