Estudio de la evolución del espaciador ribosomal intergénico 45S (IGS45S) y otras familias de ADN repetido en plantas, mediantes técnicas moleculares y citogenéticas

Resumen

Resumen de la tesis El objetivo fundamental de esta tesis fue ahondar en los procesos de evolución molecular de algunas de las distintas familias de ADN repetido que se usan de forma rutinaria en los trabajos de taxonomía, filogeografía y filogenética de plantas, para con herramientas de biología molecular (PCR, clonación, secuenciación¿) y citogenética molecular (FISH) poner a prueba las teorías generalmente aceptadas sobre los procesos de variación y homogeneización de tales secuencias repetidas. En el primer trabajo de esta tesis como compendio de artículos, utilizando la secuencia de ADN satélite E180 previamente descrita para el género Medicago, diseñamos primers específicos para (1) evaluar la robustez y sensibilidad tanto de la PCR como del FISH para detectar familias de ADN repetido, (2) obtener nuevos datos sobre la evolución genómica (cariotípica) del género Medicago usando ADNsat como marcador, y (3) evaluar el rastro filogenético dejado por una familia de ADNsat en un género tan particular como Medicago, donde se tiene la evidencia de que complejos patrones de hibridación han jugado un papel fundamental en su historia evolutiva. Nuestros resultados demuestran que la detección tanto por técnicas moleculares como citogenéticas de la familia repetida E180 es altamente reproducible a través del género, y que los patrones cromosómicos sirvieron para diferenciar complejos de especies estrechamente relacionados (son taxón-específicos). El segundo trabajo de esta tesis vino motivado por las continuas referencias bibliográficas que usaban las secuencias de la familia de ADN ribosomal nuclear 5S como marcador genético en la práctica de concatenar partes diferentes de dos genes seguidos para usarlas como pertenecientes a un mismo gen, en la creencia de que la homogeneización de secuencia dentro de la familia era completa. En consecuencia comparamos la integridad de la secuencia (longitud, motivos universales conservados y estructura secundaria) y el comportamiento filogenético de zonas 5S codificantes completas en comparación con las quiméricas (concatenadas) de un grupo de genes de ADNrn 5S obtenido de varias especies estrechamente relacionadas. Los resultados que se desprenden sugieren que la homogeneización de secuencias no está operando, ni siquiera dentro de un mismo tándem, en la región codificante del ADNrn 5S, la cual había sido tradicionalmente considerada como un ejemplo de secuencia altamente conservada. De esta manera, la generalizada práctica de concatenar secuencias de genes 5S puede incrementar la diversidad haplotípica, distorsionando los patrones de evolución génica y conduciendo a relaciones haplotípicas incorrectas en algunas reconstrucciones evolutivas. En el tercer y último trabajo de la tesis, estudiamos la secuencia del espaciador intergénico (IGS) del ADNr 45S de Ginkgo biloba y Medicago arborea respectivamente. En el caso de G. biloba, y basándonos en trabajos previos, intentamos discernir si las familias de ADNrn 45S y 5S estaban o no combinadas en el mismo locus. Usando técnicas de citogenética molecular y secuenciación de ADN mostramos que la única organización existente en esta especie es la asociada (primera vez que se demuestra en gimnospermas), donde el gen 5S aparece insertado dentro del IGS 45S. Summary of the thesis The main aim of this work was to depth into the processes of molecular evolution of some of the different families of repeated DNA that are used routinely in taxonomy, phylogeography and phylogenetics, using molecular biology (PCR, cloning, sequencing¿) and molecular cytogenetics (FISH) to assess widely accepted theories about mechanisms of variation and homogenization of such repeated sequences. In the first study of this thesis as a compendium of articles, using the DNA sequence Satellite E180 previously described for the genus Medicago, we designed specific primers (1) to assess the robustness and sensitivity of PCR and FISH to detect families of repeated DNA, (2) to obtain new data on the genomic evolution (karyotype) of the genus Medicago using satDNA as a marker , and (3) evaluate the phylogenetic trail left by a family of ADNsat on a particular genus such as Medicago, where complex patterns of hybridization have played a key role in their evolutionary history. Our results demonstrate that detection of E180 family by both molecular and cytogenetic techniques is highly reproducible across the genus, and that chromosomal patterns were useful to differentiate closely related species complexes (taxon-specific). The second paper of this thesis was motivated by the continuous references that used the sequences of the family of nuclear ribosomal DNA 5S as a genetic marker in the practice of concatenating different parts of two genes in a row to use them as belonging to the same gene, in belief that sequence homogenization within the family was complete. Therefore we compared the sequence integrity (length, conserved motifs and secondary structure) and phylogenetic behavior of complete 5S coding regions compared to the chimerics (concatenated) in a group of 5S ADNrn genes obtained of several closely related species. The results suggest that sequence homogenization is not operating, even within the same tandem, in the 5S ADNrn coding region, which had traditionally been considered as an example of highly conserved sequence. Thus, the widespread practice to concatenate sequences of 5S genes can increase the haplotype diversity, distorting patterns of genic evolution and leading to bad haplotype relationships in some evolutionary reconstructions. In the third paper we study the sequence of the intergenic spacer (IGS) of 45S rDNA of Ginkgo biloba. Based on previous works, we try to discern whether 45S and 5S ADNrn families were or were not linked within the same locus. Using molecular cytogenetic techniques and DNA sequencing showed that the only organization in this species is the associated one (first time reported in gymnosperms), where the 5S gene is inserted into the 45S IGS.