Clonación y caracterización funcional del gen atc1 que codifica la trehalasa ácida de candida allbicans

Resumen

Candida albicans es una levadura patógena oportunista, cuya incidencia clínica ha aumentado de forma dramática en los últimos años, fundamentalmente asociada con el enorme incremento experimentado en la población de personas inmunocomprometidas. La trehalosa es un disacárido muy estudiado en levaduras y hongos filamentosos donde cumple una doble función: (i) carbohidrato de reserva y (ii) compuesto protector de la integridad frente a distintas situaciones de estrés. Los genes responsables de la biosíntesis y la degradación de trehalosa en C. albicans (TPS1 y NTC1, respectivamente) han sido clonados y secuenciados. Sin embargo, este patógeno contiene un tercer gen con actividad trehalasa, de función desconocida y cuyo producto se localiza en la superficie celular. Trabajos previos sugerían que podía tratarse de una trehalasa ácida. Identificación e interrupción del gen ATC1. Después del rastreo de una base de datos del genoma de C. albicans, (http://genolist.pasteur.fr/CandidaDB) el producto de una ORF (IPF 19760/CA2574) que tiene un 41% de homología con la trehalasa ácida (Ath1p) de Saccharomyces cerevisiae, según la secuencia aminoacídica deducida (BLAST), fue identificada y denominada Atc1p (acid trehalase of Candida). Para investigar la función de Atc1p, se construyeron mutantes nulos mediante la técnica del "ura-blaster", que utiliza el casete de disrupción hisG::URA3::HisG que sustituye una parte de la ORF de ATC1. Los transformantes seleccionados fueron analizados por Southern blot para comprobar que habían insertado el fragmento deseado en el locus de ATC1. Localización de la proteína Se analizaron por Western blot las especies protéicas de las distintas fracciones subcelulares usando un anticuerpo policlonal obtenido contra un oligopéptido sintético de Atc1p. Se detectó una especie molecular de 170 KDa en el extracto de SDS de la pared celular de la cepa parental pero no en la de