Degradación de compuestos aromáticos en Rhodococcus SP. Estirpe TFB

Résumé

El proyecto de tesis denominado Degradación de compuestos aromáticos en Rhodococcus sp. estirpe TFB presentado por la doctoranda Dña. Laura Tomás Gallardo ha sido realizado en el área de Microbiología perteneciente al Departamento de Biología Molecular e Ingeniería Bioquímica de la Universidad Pablo de Olavide. El proyecto de tesis consta de cuatro bloques de resultados. En el primer bloque se ha realizado la caracterización taxonómica y fisiológica de una nueva estirpe bacteriana aislada de los fangos del río Rhin (Alemania) que se ha adscrito al género Rhodococcus y se la ha denominado Rhodococcus sp. estirpe TFB (Tomás-Gallardo et al., 2006). Una de las características más importantes de la estirpe TFB es su capacidad de metabolizar multitud de compuestos aromáticos como fuente de carbono y energía. En los siguientes bloques de resultados se han descrito las rutas de degradación de los tres compuestos aromáticos seleccionados; ftalato, tetralina y naftaleno. Para la caracterización de la degradación de estos compuestos se ha empleado una aproximación proteómica, poniendose a punto la metodología 2D-DIGE (GE Healthcare) para comparar el proteoma de la bacteria en diferentes condiciones de cultivo. Gracias a esta comparación se han identificado una serie de enzimas implicadas en la degradación de los diferentes compuestos, pudiéndose incluso caracterizar fenómenos de regulación de la expresión de las distintas enzimas. En la caracterización de la degradación de ftalato se identificaron 13 proteínas similares a enzimas implicadas en el metabolismo de este compuesto monoarómatico hasta intermediarios del metabolismo central, entre otras. Gracias al análisis proteómico se ha clonado un operón de genes cuyos productos son similares a las enzimas de degradación de ftalato hasta protocatecuato identificadas mediante el análisis proteómico, a los que denominamos genes pht. Para completar la caracterización se realizó el análisis de expresión por RT-PCR de los genes pht, además de la cuantificación de dos actividades enzimáticas que forman parte de la ruta de degradación, según la bibliografía consultada. Con los resultados obtenidos se ha podido proponer una ruta de degradación completa para el ftalato. La caracterización de la degradación de tetralina se abordó de forma similar. Con el análisis proteómico se identificaron 17 proteínas similares a enzimas descritas previamente como implicadas en la degradación de este compuesto hasta intermediarios del metabolismo central en otra estirpe bacteriana, Sphingomonas macrogolitabida estirpe TFA. Además, se ha secuenciado un fragmento de 23 kb que contiene todos los genes necesarios para degradar esta molécula (genes thn), así como los genes implicados en la regulación transcripcional de los genes thn. Se ha caracterizado la actividad enzimática del producto del gen thnD y se ha demostrado su implicación en la degradación de tetralina. La expresión de los genes thn se ha analizado mediante RT-PCR, Q-RT-PCR y con fusiones traduccionales a gfp. Además, se han determinado los inicios de la transcripción tanto de los genes estructurales como de los genes reguladores y se ha realizado un estudio de mutantes en la región promotora de los genes estructurales para caracterizar las regiones de ADN implicadas en la activación de estos genes y en la represión catabólica de los mismos. Con los resultados obtenidos se ha podido proponer una ruta de degradación completa para la tetralina además de sentar las bases del estudio de los mecanismos de regulación transcripcional que gobiernan la expresión de los genes thn. La degradación de naftaleno también se abordó de la misma forma que el ftalato y la tetralina. El resultado del análisis proteómico mostró que las proteínas Thn también están presentes en el proteoma de la estirpe TFB cuando crece con naftaleno como fuente de carbono y energía. Sin embargo, sólo las tres primeras enzimas de la ruta de degradación de tetralina podrían tener actividad sobre el naftaleno y sus intermediarios, según se ha visto en estudios previos realizados con las enzimas Thn de la estirpe TFA. Otras proteínas identificadas mostraron que la degradación de naftaleno ocurre siguiendo las rutas del salicilato y gentisato previamente descritas en otras especies bacterianas, aunque aún no se han podido clonar los genes que codificarían para las enzimas identificadas en el análisis proteómico. Durante el desarrollo de este proyecto de tesis se ha realizado una estancia con fines científicos en el laboratorio del Dr. Schlomann (Freiberg, Alemania) durante la que se determinó que la estirpe TFB posee dos plásmidos lineales, pTFB1 y pTFB2, de 1100 y 450 kb respectivamente, y se ha determinado que tanto los genes thn como los genes pht se encuentran localizados en el plásmido pTFB1.