Potencial de la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem para la detección, cuantificación y confirmación de fármacos en aguas

Resumen

Los fármacos son probablemente los contaminantes emergentes que en los últimos años han suscitado un mayor interés debido a que su presencia en el medio ambiente puede afectar a la calidad del agua y a los organismos vivos. Tras su consumo humano y/o veterinario, los fármacos pueden excretarse sin sufrir ninguna modificación o bien en forma de metabolitos, llegando a alcanzar concentraciones importantes en las aguas residuales urbanas. Los tratamientos aplicados en la mayoría de las estaciones depuradoras de aguas residuales no son suficientes para eliminarlos completamente, con lo que finalmente llegan al medio acuático. Se requiere pues metodología analítica que permita determinar de modo fiable los fármacos y sus metabolitos en el medio acuático para poder evaluar sus posibles efectos negativos sobre el medio ambiente. En esta Tesis se ha estudiado el potencial analítico y las aplicaciones del acoplamiento instrumental cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) con analizadores de triple cuadrupolo (QqQ) y con analizador híbrido cuadrupolo-tiempo de vuelo (QTOF) en la determinación de fármacos y de sus metabolitos/productos de transformación aguas de distinta naturaleza. Introducción Los fármacos son probablemente los contaminantes emergentes que en los últimos años han suscitado un mayor interés debido a que su presencia en el medio ambiente puede afectar a la calidad del agua y a los organismos vivos. Tras su consumo humano y/o veterinario, los fármacos pueden excretarse sin sufrir ninguna modificación o bien en forma de metabolitos, llegando a alcanzar concentraciones importantes en las aguas residuales urbanas [1, 2]. Los tratamientos aplicados en la mayoría de las estaciones depuradoras de aguas residuales no son suficientes para eliminarlos completamente, con lo que finalmente llegan al medio acuático. Se requiere pues metodología analítica que permita determinar de modo fiable los fármacos y sus metabolitos en el medio acuático para poder evaluar sus posibles efectos negativos sobre el medio ambiente. Esta Tesis se ha dividido en dos partes bien diferenciadas. La primera parte se centra en la determinación cuantitativa de fármacos en aguas mediante UHPLC-MS/MS con analizador de triple cuadrupolo. El objetivo principal es el desarrollo, validación y aplicación de nuevos métodos analíticos para la determinación de numerosos fármacos de muy diversas familias químicas, en aguas de distinta naturaleza [3 - 6]. La segunda parte se centra en la investigación de metabolitos y/o productos de transformación de fármacos en aguas de distintos tipos, tanto desde un enfoque cualitativo (utilizando un analizador QTOF) como cuantitativo (QqQ) [7, 8]. Metodología La metodología de trabajo seguida para el desarrollo de métodos analíticos cuantitativos ha sido la siguiente: 1. Selección de los fármacos más relevantes tanto desde el punto de vista del consumo humano como del riesgo medioambiental. 2. Optimización de las condiciones de MS y MS/MS mediante la infusión individual de los patrones analíticos. 3. Optimización de la separación cromatográfica mediante la inyección de patrones en disolución. Elección de la fase móvil y del gradiente para obtener picos cromatográficos y tiempos de retención adecuados. 4. Aplicación y estudio de la eficacia de SPE para la extracción y preconcentración de las muestras, mediante el análisis de muestras blanco fortificadas antes y después de la extracción y de patrones de la misma concentración para evaluar las posibles pérdidas durante el proceso de extracción. 5. Estudio del efecto matriz en los métodos LC-MS/MS desarrollados mediante el análisis de muestras fortificadas de diversos tipos y procedencias, así como de patrones en solvente. Estudio de posibles soluciones que no supongan un aumento del tiempo de análisis ni de la manipulación de la muestra y que resulten adecuadas para un método multirresidual. Importancia del uso de patrones internos marcados isotópicamente. 6. Validación del los métodos desarrollados y optimizados evaluando la linealidad, exactitud y precisión mediante ensayos de recuperación a varios niveles de concentración. Estimación del límite de detección y del límite de cuantificación del método. 7. Aplicación de la metodología analítica desarrollada al análisis de aguas de distinta naturaleza (influente, efluente y superficial). 8. Confirmación de la identidad de los compuestos detectados en las muestras mediante el cálculo de la relación iónica (intensidad de la señal para las transiciones seleccionadas) en muestras y patrones. 9. Discusión de los resultados obtenidos y establecimiento de conclusiones relativas a la presencia de fármacos en las aguas analizadas. La metodología general seguida para el análisis cualitativo ha sido la siguiente: 1. Inyección de la muestra en UHPLC-QTOF y adquisición del espectro de masas full scan en modo MSE a baja y a alta energía de colisión. 2. Extracción de la masa exacta de la molécula protonada (o desprotonada) de cada compuesto a partir del espectro a baja energía, originando un cromatograma de ión extraído (XIC) donde la presencia de un compuesto en la muestra conduce al correspondiente pico cromatográfico. 3. Cálculo del error de la masa experimental con respecto a la masa exacta teórica. 4. Identificación de los iones fragmento más relevantes en el espectro a alta energía (si el compuesto investigado está realmente presente en la muestra, el tiempo de retención de los picos cromatográficos obtenidos al realizar XICs a las masas exactas de los fragmentos debe ser el mismo que el de la molécula protonada y mostrar la misma forma de pico). 5. Cálculo del error de masa de los iones fragmento. 6. Deducción de sus estructuras mediante el software adecuado (MassFragment) o por predicción, teniendo en cuenta las diferencias estructurales con el fármaco de partida, y evaluación de la información mediante búsqueda bibliográfica. 7. Análisis de muestras de agua e investigación de metabolitos/TPs de fármacos en las mismas siguiendo la metodología desarrollada. Identificación tentativa sobre la base de la información aportada por QTOF MS. 8. En el caso de disponer de patrones comerciales, inyección y comparación de sus masas exactas, iones fragmento y tiempos de retención, con el fin de proceder a la identificación inequívoca del metabolito detectado. Conclusiones Del trabajo realizado en esta Tesis Doctoral, se pueden extraer las siguientes conclusiones generales: 1. La cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas con analizador de triple cuadrupolo es una técnica muy valiosa para la determinación (cuantificación y confirmación) de fármacos y de metabolitos/productos de transformación en diferentes tipos de aguas. 2. El desarrollo y aplicación de métodos multirresiduales en los que se incluye un elevado número de fármacos de diversas familias requiere un compromiso en cuanto a la selección de las condiciones experimentales más adecuadas: separación cromatográfica, detección MS/MS y tratamiento de la muestra. La corrección del efecto matriz ha resultado ser la fase más complicada cuando se analizan diversos tipos de aguas. Este efecto es mucho más severo en el caso de matrices complejas (influente y efluente) y su corrección cuando se trata de métodos multirresiduales resulta complicada. El uso de analitos marcados isotópicamente como patrones internos y la dilución de las muestras han sido las estrategias utilizadas para corregir/minimizar el efecto matriz en esta Tesis. 3. La validación de los métodos analíticos en diferentes muestras de agua ha proporcionado una visión más realista sobre el comportamiento y robustez del método en situaciones reales en las que deben analizarse distintas muestras, ya que la composición de las aguas es muy variable, aún siendo todas del mismo tipo (ej. superficiales). 4. El acoplamiento UHPLC-QTOF MS se ha mostrado como una herramienta analítica muy valiosa para la detección e identificación de metabolitos/TPs de fármacos en muestras medioambientales. 5. Los resultados obtenidos en los análisis realizados por QTOF y QqQ demuestran que los metabolitos de los fármacos están presentes en el agua, incluso con mayor frecuencia y a niveles de concentración más altos que los fármacos de partida. Por este motivo, se requiere ampliar la investigación sobre estos compuestos y desarrollar más metodología analítica que la que existe actualmente. Bibliografía [1] Gros, M., Petrovic, M., Barceló, D. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 386 (2006) 941-952. [2] Nikolaou, A., Meric, S., Fatta, D. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 387 (2007) 1225-1234. [3] Gracia-Lor, E., Sancho, J.V., Hernández, F. Journal of Chromatography A, 1217 (2010) 622-632 [4] Gracia-Lor, E., Sancho, J.V., Hernández, F. Journal of Chromatography A, 1218 (2011) 2264-2275 [5] Gracia-Lor, E., Sancho, J.V., Serrano, R., Hernández, F. Chemosphere, 87 (2012) 453-462 [6] Gracia-Lor, E., Martínez, M., Sancho, J.V., Peñuela, G, Hernández, F. 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