Caracterización de nuevos aislados de acanthamoeba y evaluación in vitro de la actividad amebicida de nanoparticulas dentríticas

Resumen

Las amebas de vida libre (AVL) del género Acanthamoeba son patógenos oportunistas capaces de vivir tanto como organismos de vida libre como parásitos, y que aparecen en distintos ambientes. Hoy en día se sabe que especies de este género son el agente etiológico responsable de patologías tales como la encefalitis amebiana granulomatosa, la queratitis amebiana y la acantamebiasis cutánea. En las últimas décadas, se ha producido un notable incremento en el número de casos descritos de queratitis amebiana, aunque se piensa que está subestimado. Las patologías son de difícil tratamiento, bien por una falta de terapia eficaz, bien por la aparición de resistencias por parte del parásito o bien por un diagnóstico erróneo o tardío. Por ello es primordial realizar el adecuado aislamiento e identificación del organismo en los pacientes y, por supuesto, buscar nuevos compuestos que puedan ser eficaces para el tratamiento y/o control de cualquier especie de Acanthamoeba. En este sentido se ha estudiado el efecto amebicida de compuestos de nueva síntesis (dendrímeros y dendrones) sobre especies de Acanthamoeba aisladas de muestras ambientales y clínicas, así como de colección. En casi un 50% de las muestras ambientales analizadas se detectó Acanthamoeba, siendo mayor su presencia en torres de refrigeración (69,2%) que en aguas calientes sanitarias (18,2%). Uno de los aislados ambientales se caracterizó e identificó como A. castellanii (A. castellanii UAH-T17c3), mostrando un bajo grado de patogenicidad. El aislado clínico se caracterizó e identificó como A. griffini MYP2004, teniendo este un alto grado de patogenicidad. En cuanto a las condiciones de cultivo, el medio PYG suplementado con un 2% de Bactocasitona fue el que permitía un mejor crecimiento y mantenimiento de los trofozoitos en incubaciones prolongadas. Con el objeto de estudiar la viabilidad de los trofozoítos cuando fueran tratados con sustancias amebicidas, se analizaron diferentes métodos: PrestoBlue®, Resazurina, MTT y CellTiter 96®, comparando con el recuento mediante microscopía óptica usando rojo Congo. Ninguno de los métodos se consideró idóneo para estudios de viabilidad, ya que la señal era baja o sobreestimaba el número de trofozoítos viables. También se analizó una nueva técnica fluorimétrica basada en la medida de consumo de oxígeno. Esta última mostró una gran correlación con el recuento con microscopio óptico. Finalmente, se estudió el efecto amebicida de dendrímeros y dendrones sobre trofozoítos y quistes de cepas aisladas y otras de colección. Los resultados mostraron que el efecto amebicida era variable y dependiente de la estructura de los compuestos y tiempos de incubación. Se comprobó que los mejores compuestos eran aquellos que tenían núcleo polifenólico y azufre en su estructura, seleccionándose un dendrímero con una alta capacidad amebicida, que además mostró baja toxicidad frente a distintas líneas celulares. Dicho compuesto mostraba una actividad amebicida similar al fármaco usado en el tratamiento de la queratitis amebiana (clorhexidina digluconato), poniéndose de manifiesto mediante ensayos de viabilidad y estudios estructurales y ultraestructurales de las alteraciones producidas sobre los trofozoítos y quistes. Sin embargo, cuando el dendrímero fue usado en combinación con dicho fármaco, los resultados indicaban que se producía un claro efecto sinérgico, ya que en combinación se obtenían reducciones en la viabilidad que no eran la suma del efecto de cada uno de los compuestos por separado. El tratamiento de quistes con la combinación de ambos compuestos, aunque no impedía el desenquistamiento, a concentraciones de 4 mg/l de cada uno de ellos en la mezcla provocaba que los trofozoítos procedentes del desenquistamiento no proliferasen y perdiesen la viabilidad al cabo de una semana