Evaluación de la actividad recombinasa e integrase sitio-específica de relaxasas conjugativas en bacterias y en células humanas

Resumen

Las relaxasa conjugativas son las proteínas responsables del procesamiento del ADN que es transferido desde una bacteria donadora a una receptora durante la conjugación bacteriana. Aparta de su papel en conjugación, algunas relaxasas (como TrwC, la relaxasas del plásmido R388) tienen actividad recombinasa e integrasa sitio-específica. Este trabajo se ha centrado en la caracterización molecular de dichas reacciones en distintas relaxasas. Los objetivos concretos que nos planteamos en su inicio fueron: profundizar en el estudio del mecanismo por el que la relaxasa R388_TrwC cataliza la recombinación e integración, analizar la presencia de las mencionadas actividades en otras relaxasas relacionadas a TrwC y explorar el potencial uso de TrwC para mediar la integración sitio-específica de ADN foráneo en el genoma humano. Con el fin de caracterizar los residuos clave de la proteína implicados, hemos llevado a cabo una extensa mutagénesis del gen de TrwC que sugiere que su actividad recombinasa no se puede mejorar alterando únicamente uno o dos residuos. Además, hemos analizado los requerimientos de ADN de la reacción de integración mediada por TrwC y hemos encontrado que dichos requerimientos son distintos para el inicio y el final de la reacción, siendo en el último caso menos estrictos. Aparte, hemos encontrado que las relaxasas de los plásmidos F y pKM101 también tienen actividad recombinasa sitio-específica, en contra de lo que se había publicado previamente. Sin embargo, todo parece indicar que su eficiencia como recombinasas es mucho más baja que la de TrwC. En cambio, no hemos detectado integración mediada por F_TraI, lo que sugiere diferencias con TrwC. Por último, hemos estudiado el potencial uso de TrwC para ingeniería genética en células humanas. Mediante el uso de un sistema de secreción tipo IV bacteriano, introdujimos complejos TrwC-ADN en células humanas. Mediante la adición de un gen de resistencia a antibiótico y la posterior selección, fuimos capaces de obtener células humanas en las que el ADN se había integrado de manera estable. Los sitios en los que se había producido dicha integración fueron caracterizados mediante la técnica LAM-PCR (linear amplification-mediated PCR). Encontramos que TrwC es activa en células humanas y que puede catalizar la integración sitio-específica, aunque no eficientemente, ya que la inmensa mayoría de los eventos de integración analizados reflejaron una integración al azar. Sin embargo, la comparación de las tasas de integración obtenidas con TrwC y la relaxasa pBGR1_Mob sugiere que, una vez en el núcleo de la célula humana, TrwC podría estar estabilizando o protegiendo el ADN, favoreciendo su posterior integración al azar. Los resultados de este trabajo sugieren que las actividad recombinasa e integrasa de las relaxasas conjugativas no es algo tan inusual como se pensaba, sugiriendo la existencia de toda una familia de relaxasas con dichas habilidades. Además, hemos iniciado la exploración de su potencial uso con fines biotecnológicos para la modificación de células humanas.