Ardc, proteína antirestricción que amplía el rango de huésped del plásmido

Resumen

Introducción: La transferencia génica horizontal (HGT) es el mecanismo por el cual elementos genéticos móviles (MGEs), como el ADN plasmídico, se transfieren a una célula sin relación con el organismo que los poseían inicialmente. La relevancia clínica del proceso HGT radica en la adquisición y diseminación de genes involucrados en conferir resistencia bacteriana a antibióticos (AbR) entre patógenos no relacionados. Cuando las bacterias se enfrentan a presiones selectivas como las que ejercen los antibióticos, la adquisición horizontal de AbR permite la diversificación de los genomas, lo que aumenta las oportunidades de supervivencia. La conjugación bacteriana es el principal proceso de HGT que permite la transferencia de genes codificados en plásmidos autónomos. Este proceso requiere que la maquinaria construya un contacto directo entre una célula donadora y una célula receptora (1). La conjugación puede ser modulada por factores ambientales o estrategias bacterianas basadas en enfoques genéticos codificados en el cromosoma (barreras del huésped) o el ADN plasmídico (barreras de plásmidos). Las barreras plasmídicas incluyen la exclusión de entrada (2) o la inhibición de la fertilidad (3) que reducen la transferencia conjugativa. Las barreras del huésped pueden estar mediadas a través de la modulación de respuesta SOS (4, 5), los sistemas CRISPR-Cas (6) o los sistemas de restricción y modificación (R-M). Los sistemas R-M permiten a las bacterias discernir entre el ADN propio y el ADN extraño que invade la célula, lo que lleva a su destrucción. Requieren dos actividades enzimáticas: una metiltransferasa que proporciona protección a su propio ADN y una endonucleasa que escinde el ADN invasor no metilado (7). Hay cuatro grupos principales de sistemas R-M. El sistema Tipo I R-M requiere tres genes: hsdR, hsdM y hsdS y sus productos se asocian en complejos R2M2S. La subunidad S reconoce secuencias de 13-15 pb, generalmente asimétricas y bipartitas. La escisión del ADN se produce en un lugar alejado del sitio de reconocimiento (8–10). Hay una carrera armamentista coevolutiva entre las bacterias, para evitar la entrada de moléculas extrañas de ADN, y estas moléculas de ADN de plásmidos o bacteriófagos para invadir un potencial huésped evitando la restricción de los sistemas R-M bacterianos. Los mecanismos antirrestricción para contrarrestar los sistemas R-M se pueden dividir en cuatro tipos principales según su modo de acción: modificación del ADN, oclusión transitoria de los sitios de restricción, sabotaje de las actividades R-M del huésped e inhibición de las enzimas de restricción (9). El plásmido R388 es el prototipo del grupo de plásmidos de incompatibilidad IncW. Los plásmidos IncW tienen un número de copias bajo, una amplia gama de AbR y un amplio rango de hospedadores (BHR) (11). R388 tiene 35 genes clasificados en grupos funcionales o módulos, entre ellos, un gen que codifica una proteína antirrestricción llamada ArdC (11). Objetivo: El estudio de las estrategias utilizadas por los plásmidos para ser altamente promiscuos y los mecanismos para escapar de los sistemas R-M de las células receptoras es esencial en la lucha contra la propagación de los genes de resistencia a los antibióticos. Por este motivo, el principal objetivo de esta tesis es la caracterización del papel y el mecanismo de acción de la proteína antirrestricción ArdC a través de un enfoque biológico, bioquímico y estructural. Resultados: ArdC es una proteína codificada por un gen que se encuentra en una zona con función de estabilidad y mantenimiento en el plásmido R388, definida como “no esencial”, y que ya fue delecionada en el pasado (12). Se vio que esta región de establecimiento era necesaria para conjugar desde E. coli hacia P. putida y mejoraba la frecuencia de conjugación hacia A. tumefaciens pero no hacia otras E. coli (12). En esta tesis, se ha construido mediante el método Wanner (13) el plásmido pLGM25 (R388∆ardC) para hacer ensayos de conjugación y ver si el efecto observado por del Campo se debe principalmente a que se delecionó el gen ardC. En efecto, ardC no parece ser imprescindible in vivo a la hora de transferir R388 de E. coli a E. coli, pero sí de E. coli a A. tumefaciens y especialmente de E. coli a P. putida en las condiciones de laboratorio en las que se han llevado a cabo los ensayos de conjugación. La ausencia de ardC reduce la frecuencia de conjugación hacia P. putida más de dos órdenes de magnitud, luego esta proteína está facilitando de algún modo la entrada del plásmido en estas células receptoras y, por tanto, está aumentando el rango de hospedador. Solo sobreexpresando ardC en las células receptoras se complementa pLGM25 y se recuperan los valores de frecuencia de conjugación del plásmido original. Luego es en las células receptoras, y una vez que el plásmido se encuentra en forma de cadena doble, cuando ArdC se empieza a producir y a ejercer su actividad. Se llevaron a cabo estudios de transcriptómica comparada mediante RNA-seq para intentar entender el papel de ardC en la conjugación interespecífica de E. coli a P. putida. Mediante el análisis transcripcional de donadoras, receptoras y niveles de expresión de los genes de los plásmidos, hemos observado que cuando ardC está presente en el plásmido se producen eventos de conjugación que generan una respuesta SOS en las células receptoras. Sin embargo, cuando ardC no está presente en el plásmido la conjugación no es efectiva y la respuesta SOS está reprimida en estas células donadoras. Mediante cristalografía de rayos X, hemos resuelto la estructura de ArdC (PDB: 6I89, 2.00 Å) y hemos visto que está compuesta por dos dominios estructurales. Hemos encontrado por homología con otras proteínas con estructura resuelta que ArdC posee un dominio de unión al ADN de cadena sencilla y un dominio metaloproteasa. Hemos comprobado por ensayos de retardo en gel que ArdC in vitro une ADN de cadena sencilla con mayor afinidad que ADN de cadena doble, tal y como había observado previamente el grupo de Belogurov (14). ArdC mostró una mayor estabilidad térmica en presencia de Ni2+, Mn2+ y Co2+ (ΔTM> 5 °C) gracias a su dominio metaloproteasa de tipo gluzinzina. De hecho, resolvimos la estructura de ArdC a 2.7 Å coordinando tetraédricamente un átomo de Mn a través de H201, H205, E229 y una molécula H2O (PDB: 6SNA). Siendo ArdC una proteína de unión a ADN con un dominio de metaloproteasa, hemos comprobado si esta actividad proteolítica es necesaria para la actividad de ArdC en conjugación. Mutamos el gen ardC a ardC_E229A para generar el plásmido pLGM33 codificante de una proteína inactiva. Sorprendentemente, la frecuencia de conjugación de E. coli a P. putida del plásmido mutado resultó ser como la del plásmido original. Por lo tanto, la actividad metaloproteasa de ArdC no es necesaria para la actividad de ampliación del rango de hospedador, al menos a P. putida. Para descubrir cuál pudiera ser la diana de actuación de ArdC, hicimos el experimento de conjugación de E. coli hacia diferentes mutantes de P. putida. En primer lugar, comprobamos que RecA no fuese la diana de ArdC. A continuación, elegimos una cepa receptora especialmente diseñada para la expresión heteróloga de genes, P. putida KT2440 EM42 (Δprophage1 Δprophage4 Δprophage3 Δprophage2 ΔTn7 ΔendA-1 ΔendA-2 ΔhsdRMS Δflagellum ΔTn4652) (15) y vimos que ArdC no era necesaria para conjugar eficientemente a esta cepa. Por tanto, procedimos a evaluar cada una de sus mutaciones individualmente y vimos que para conjugar hacia la cepa sin sistema de restricción modificación (P. putida ΔhsdRMS) no se precisa ardC en el plásmido. Discusión: ArdC es una proteína que facilita la conjugación entre bacterias de especies diferentes, por tanto, podemos decir que amplía el rango de hospedador del plásmido. Por este hecho, ArdC contribuye a la adaptabilidad (o “fitness”) del plásmido en distintos ambientes. Además, hemos visto que actúa en las células receptoras, al contrario de lo que se pensaba hasta ahora (14). Por otro lado, hemos visto por experimentos de RNA-seq que la conjugación genera en las células receptoras la activación de la respuesta SOS tal y como se había visto anteriormente (16). ArdC es una proteína de unión a ADN, como fue inicialmente descrita por (14). Además, contiene un dominio metaloproteasa cuya actividad no es necesaria para la actividad protectora en conjugación hacia P. putida. Finalmente, hemos comprobado la actividad anti restricción de ArdC al comprobar que la proteína no es necesaria para conjugar hacia células receptoras que carecen de sistemas de restricción-modificación. Conclusiones: 1. ArdC es necesaria para la conjugación interespecífica de R388 de E. coli a P. putida o A. tumefaciens. Por tanto, ArdC expande el rango de huésped del plásmido. 2. El rol de ArdC en la expansión del rango de conjugación se ejerce en las células receptoras. 3. ArdC actúa contrarrestando el sistema de R-M de Tipo I de las células receptoras P. putida. 4. ArdC de R388 posee dos dominios estructurales: un dominio de unión a ADN de cadena sencilla y un dominio metaloproteasa. 5. La actividad del dominio metaloproteasa de ArdC no es necesaria para la conjugación hacia P. putida. 6. La respuesta SOS está activada en las células receptoras durante la transferencia de R388 de E. coli a P. putida. Referencias: 1. Soucy SM, Huang J, Gogarten JP (2015) Horizontal gene transfer: Building the web of life. Nat Rev Genet 16(8):472–482. 2. Garcillán-Barcia MP, de la Cruz F (2008) Why is entry exclusion an essential feature of conjugative plasmids? Plasmid 60(1):1–18. 3. Frost LS, Koraimann G (2010) Regulation of bacterial conjugation: Balancing opportunity with adversity. Future Microbiol 5(7):1057–1071. 4. Petrova V, Chitteni-Pattu S, Drees JC, Inman RB, Cox MM (2009) An SOS Inhibitor that Binds to Free RecA Protein: The PsiB Protein. Mol Cell 36(1):121–130. 5. Bagdasarian M, et al. (1992) PsiB, and anti-SOS protein, is transiently expressed by the F sex factor during its transmission to an Escherichia coli K-12 recipient. Mol Microbiol 6(7):885–893. 6. Marraffini LA (2015) CRISPR-Cas immunity in prokaryotes. Nature 526(7571):55–61. 7. Gormley NA, Watson MA, Halford SE (2005) Bacterial Restriction–Modification Systems. Encycl Life Sci:1–11. 8. Wilkins BM (2002) Plasmid promiscuity: meeting the challenge of DNA immigration control. Environ Microbiol 4(9):495–500. 9. Mark R Tock and David TF Dryden (2005) The biology of restriction and anti-restriction. Curr Opin Microbiol 8:466–472. 10. Murray NE (2000) Type I restriction systems: Sophisticated molecular machines. Microbiol Mol Biol Rev 64(2):412–434. 11. Fernández-López R, et al. (2006) Dynamics of the IncW genetic backbone imply general trends in conjugative plasmid evolution. FEMS Microbiol Rev 30(6):942–966. 12. del Campo I (2016) Estudio de la red de regulación global de R388. Dissertation (University of Cantabria. PhD Thesis). 13. Datsenko KA, Wanner BL (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci 97(12):6640–6645. 14. Belogurov AA, et al. (2000) Antirestriction protein Ard (Type C) encoded by IncW plasmid pSa has a high similarity to the “protein transport” domain of TraC1 primase of promiscuous plasmid RP4. J Mol Biol 296:969–977. 15. Martínez-García E, Nikel PI, Aparicio T, de Lorenzo V (2014) Pseudomonas 2.0: Genetic upgrading of P. putida KT2440 as an enhanced host for heterologous gene expression. Microb Cell Fact 13(1):1–15. 16. Baharoglu Z, Mazel D (2014) SOS, the formidable strategy of bacteria against aggressions. FEMS Microbiol Rev 38(6):1126–1145.