Regulación post-traduccional del transportador de nucleósidos cnt2. Detección de proteínas de interacción

Resumen

El transportador de nucleósidos purino-preferente CNT2 participa en la captación de purinas desde el medio extracelular. Trabajos previos a esta tesis le han asignado funciones más allá de la recuperación de nucleósidos. En este trabajo, se aportan evidencias sobre un novedoso mecanismo de regulación post-traduccional del transportador, según el cuál en un modelo de hígado los ácidos biliares incrementan la cantidad de CNT2 insertado en membrana plasmática sin que se detecte un aumento de la síntesis de proteína. Esta respuesta va ligada a la vía de señalización Ras/Raf/MEK/ERK e implica la participación de la red microtubular. En un segundo bloque se procede a realizar un estudio bioinformático de los potenciales motivos de fosforilación o con implicación en los procesos de direccionamiento y tráfico intracelular, encontrando una mayor densidad en el extremo N-terminal citosólico. Por ello se elige este fragmento para realizar un doble screening de las posibles proteínas de interacción para CNT2, cuyo interactoma es desconocido hasta el momento. En este sentido, se realiza un screening de doble híbrido en bacterias con sendas librerías de hígado y riñón y una aproximación por GST pull-down seguida de elecroforesis bidimensional. Estos estudios permiten definir nuevos mecanismos de regulación de CNT2 por interacción con la chaperona GRP58 y con el gen glucolítico aldolasa B, ambas susceptibles de ser moduladas en función de la asequibilidad de glucosa. Para GRP58 se corrobora la interacción por co-inmunoprecipitación y mediante la generación y purificación de una construcción 6xHis-CNT2. GRP58 colocaliza con CNT2 en la membrana plasmática de células Hela y provoca una disminución de la actividad del transportador, al mismo tiempo que en células IEC6 se detecta que los niveles de ambas proteínas correlacionan de forma inversa dependiendo de la asequibilidad de glucosa. Asimismo, la inhibición funcional de esta proteína, mediada por bacitracina, provoca un incremento de la actividad de la chaperona. Para la aldolasa B también se demuestra su colocalización con el transportador en células HeLa cotransfectadas, mientras que en la línea derivada de heptoma Fao, se describe una incremento transitorio de la actividad de CNT2 en respuesta a diferentes sustratos glucolíticos, entre los que destaca la fructosa. La tesis aporta nuevos mecanismos de regulación para el transportador CNT2 que implican el acoplamiento entre la captación de nucleósidos y el metabolismo energético.