Regulació del transportador de nucleòsids d'alta afinitat hcnt3 per proteïnes d'interacció

Resumen

Els transportadors de nucleòsids pertanyen a les famílies gèniques SLC28 i SLC29 que codifiquen pels transportadors de nucleòsids concentratius (hCNTs) i transportadors de nucleòsids equilibratius (hENTs), respectivament. La família dels hENTs inclou quatre membres: hENT1, hENT2, hENT3 i hENT4. Aquests realitzen el transport de nucleòsids o dels anàlegs derivats de nucleòsids a favor de gradient de concentració, són independents de sodi i poden transportar bidireccionalment. Les proteïnes hENT1 i hENT2, les millor caracteritzades, transporten purines i pirimidines però amb baixa afinitat. La família de hCNTs està formada per tres membres: hCNT1, 2 i 3. hCNT1 transloca pirimidines i hCNT2 purines i uridina mitjançant un mecanisme unidireccional amb una estequiometria d’un catió de sodi per cada nucleòsid transportat. hCNT3 presenta una àmplia selectivitat de substrat transportant tant nucleòsids purínics com pirimidínics, així com els seus anàlegs, inclosos alguns derivats de nucleobases com les tiopurines amb una estequiometria de 2 sodis per cada nucleòsid. Per altra banda, sabem que les proteïnes CNTs d’eucariotes han incorporat evolutivament un domini N-terminal que no està present als procariotes, encara que aquests ortòlegs més primitius són totalment funcionals. D’això es dedueix que aquesta zona N-terminal no és essencial per a l’activitat transportadora però sí que sembla que conté zones reguladores, tal i com s’ha començat a comprovar. Per aquest motiu es pot hipotetitzar que el domini N-terminal d’hCNT3 pot ser rellevant per tal de comprendre totes aquelles funcions associades a aquesta proteïna transportadora, no necessàriament vinculades estrictament a la seva activitat com a transportador. Aquesta tesi s’ha estructurat en dos grans blocs, un que fa referència a l’estudi de les possibles proteïnes d’unió amb el transportador, conferint-li així aquestes noves funcions reguladores que es postulen gràcies aquest nou domini adquirit en eucariotes. I l’altre bloc referent a l’estudi de la pròpia funció transportadora de la proteïna, específicament del transport d’acadesina (AICAR). Una primera aproximació proteòmica (Pull Down) amb el domini N-terminal d’hCNT3 ha permès identificar recentment proteïnes com Galectina-4 (Gal-4), l’Adenosina Quinasa (ADK) com a possibles proteïnes d’interacció amb hCNT3, utilitzant com a font de proteïnes un homogenat de còlon, per Gal-4 i un extracte proteic de mostres de pacients amb Leucèmia Limfàtica Crònica (LLC) per l’ADK. S’ha pogut veure com el transportador hCNT3 interacciona amb la proteïna Gal-4 i fa que el transportador es dirigeixi cap a la membrana plasmàtica en la línia cel·lular HT-29. Paral·lelament també s’ha comprovat que hCNT3 interacciona amb ADK, a diferència de la unió descrita anteriorment, aquesta interacció provoca un canvi en l’eficiència per transportar adenosina, per tant, el transportador podria regular els nivells d’adenosina extracel·lulars. Un altre aspecte que s’ha estudiat ha estat el paper dels transportadors hCNT en la captació d’acadesina (AICAR), un anàleg de nucleòsid que s’ha descrit que pot inhibir la proliferació cel·lular i induir apoptosi a diferents tipus de tumors i leucèmies, entre elles la LLC, model el qual es va identificar la interacció amb ADK. En la present tesi, s’ha descrit que els transportadors responsables de la internalització d’AICAR són hCNT3 i hENT1. Posteriorment es va analitzar si el fet que aquest fàrmac tingués dues vies d’entrada tenia algun efecte fisiològic per la cèl·lula. Ja que una de les vies esdevenia més eficient al interaccionar amb ADK, enzim que fosforila AICAR a AICA ribotide (ZMP) per ser actiu. Per tant, s’esperava era que el transport d’AICAR per hCNT3 es traduís en més activació d’AMPK ja que hCNT3 està interaccionant amb l’ADK. No obstant, es va observar que l’efecte inductor de l’AMPK l’exerceix majoritàriament l’AICAR que s’interioritza per hENT1. s’ha de tenir en compte que l’aportació d’hCNT3 al model utilitzat és molt minoritària. Podríem dir que en aquest treball s’han generat les primeres evidències que demostrarien que el transportador hCNT3 pot interaccionar amb altres proteïnes, adquirint noves funcions per la cèl·lula o per acabar de madurar i poder realitzar la seva funció.