Estabilidad de genotipos de Streptococcus mutans en escolares usando la técnica AP-PCR y el cebador OPA-2

Resumen

Streptococcus mutans es la bacteria más relacionada con el proceso cariogénico. Existe una ventana de infectividad en la que e sta bacteria coloniza por primera vez la cavidad oral del niño y en la que queda demostrada una transmisión vertical desde sus padres. Posteriormente se ha descrito una segunda ventana de infectividad que parece estar íntimamente relacionada con la erupción de la dentición permanente. Desde el punto de vista epidemiológico es esencial determinar los posibles mecanismos de transmisión mediante un método eficaz de tipificación a través de técnicas de biología molecular. En este sentido, una de las aplicaciones de la genotipificación ha sido la investigación de la estabilidad de las bacterias orales. La presencia estable de u n determinado clon convierte al hospedador que lo porta en un i ndividuo potencialmente importante en la cadena de transmisión de estos microorganismos. En nuestro trabajo se ha investigado la estabilidad y la transmisión horizontal en escolares de Primero de Educación Primaria durante un periodo de 18 meses, también se estudió si el grado de diversidad genotípica guardaba o no relación con el estado de caries del hospedador medido a través de distintos indicadores. Se seleccionó una población de 67 escolares de dos colegios a los que se les recogió saliva estimulada en dos momentos separados por 18 meses. Se evaluó el estado de salud oral y a todos ellos se les realizó el test de CRT® Bacteria p ara recuentos de estreptococos del grupo mutans (EGM) y lactobacilos (LB). También a partir de saliva se hicieron diluciones seriadas en tampón fosfato desde las que se inocularon placas de agar MSB. Tras incubación en anaerobiosis a 37ºC durante 48 horas, se procedió a la selección de colonias de EGM desde la di lución óptima de acuerdo al morfotipo de las mismas. Estas colonias se inocularon en caldo de manitol para su identificación bioquímica. Todas las cepas se conservaron liofilizadas y en TSB con glicerol al 50% a -80 C. Una vez tomada una alícuota de e ste último se les realizó AP-PCR. La extracción de ADN se hizo a partir de un c ultivo en caldo de Wilkins-Chalgren. Se utilizó el kit Wizard Genomic (Promega Al120) siguiendo las pautas recomendadas por la casa comercial. La amplificación se efectuó con el cebador OPA -02 Y el producto se sometió a electroforesis (100V 4 horas y 3 O minutos) en gel de agarosa adicionado de bromuro de etidio para su revelado. Los geles se llevaron a un transiluminador ultravioleta y se fotografiaron con cámara digital para almacenarlos en formato TIFF. Tras un análisis visual de las bandas, se confirmó la identidad genotípica con el programa Fingerprinting II Informatix Software, el cual además permitió establecer gr upos de homología de ADN. También se establecieron comparaciones entre los genotipos evaluados a nivel basal y los hallados a los 18 meses para comprobar la estabilidad, la pérdida o adquisición de estos y, en el caso de esto último, si se habían producido desde sus compañeros de clase lo que pondría de manifiesto una transmisión horizontal entre ellos.%&/De acuerdo con nuestros resultados s e demostró que el medio MSB no es plenamente selectivo, que la mayoría de los niños estudiados presentaban 1 o 2 genotipos d iferentes y que sólo a los 18 meses se detectaron escolares que portaban 3 distintos. Se demostró un alto grado de estabilidad de los genotipos investigados y quedó puesta de manifiesto la existencia de genotipos compartidos en escolares de ambos cent ros y por tanto una transmisión horizontal. Finalmente no se en contró asociación significativa entre el número de genotipos y los distintos indicadores de caries. Streptococcus mutans es la bacteria más relacionada con el proceso cariogénico. Existe una ventana de infectividad en la que esta bacteria coloniza por primera vez la cavidad oral del niño y en la que queda demostrada una transmisión vertical desde sus padres. Posteriormente se ha descrito una segunda ventana de infectividad que parece estar íntimamente relacionada con la erupción de la dentición permanente. Desde el punto de vista epidemiológico es esencial determinar los posibles mecanismos de transmisión mediante un método eficaz de tipificación a través de técnicas de biología molecular. En este sentido, una de las aplicaciones de la genotipificación ha sido la investigación de la estabilidad de las bacterias orales. La presencia estable de u n determinado clon convierte al hospedador que lo porta en un individuo potencialmente importante en la cadena de transmisión de estos microorganismos. En nuestro trabajo se ha investigado la estabilidad y la transmisión horizontal en escolares de Primero de Educación Primaria durante un periodo de 18 meses, también se estudió si el grado de diversidad genotípica guardaba o no relación con el estado de caries del hospedador medido a través de distintos indicadores. Se seleccionó una población de 67 escolares de dos colegios a los que se les recogió saliva estimulada en dos momentos separados por 18 meses. Se evaluó el estado de salud oral y a todos ellos se les realizó el test de CRT® Bacteria p ara recuentos de estreptococos del grupo mutans (EGM) y lactobacilos (LB). También a partir de saliva se hicieron diluciones seriadas en tampón fosfato desde las que se inocularon placas de agar MSB. Tras incubación en anaerobiosis a 37ºC durante 48 horas, se procedió a la selección de colonias de EGM desde la di lución óptima de acuerdo al morfotipo de las mismas. Estas colonias se inocularon en caldo de manitol para su identificación bioquímica. Todas las cepas se conservaron liofilizadas y en TSB con glicerol al 50% a -80 C. Una vez tomada una alícuota de este último se les realizó AP-PCR. La extracción de ADN se hizo a partir de un cultivo en caldo de Wilkins-Chalgren. Se utilizó el kit Wizard Genomic (Promega Al120) siguiendo las pautas recomendadas por la casa comercial. La amplificación se efectuó con el cebador OPA -02 Y el producto se sometió a electroforesis (100V 4 horas y 3 O minutos) en gel de agarosa adicionado de bromuro de etidio para su revelado. Los geles se llevaron a un transiluminador ultravioleta y se fotografiaron con cámara digital para almacenarlos en formato TIFF. Tras un análisis visual de las bandas, se confirmó la identidad genotípica con el programa Fingerprinting II Informatix Software, el cual además permitió establecer grupos de homología de ADN. También se establecieron comparaciones entre los genotipos evaluados a nivel basal y los hallados a los 18 meses para comprobar la estabilidad, la pérdida o adquisición de estos y, en el caso de esto último, si se habían producido desde sus compañeros de clase lo que pondría de manifiesto una transmisión horizontal entre ellos. De acuerdo con nuestros resultados s e demostró que el medio MSB no es plenamente selectivo, que la mayoría de los niños estudiados presentaban 1 o 2 genotipos diferentes y que sólo a los 18 meses se detectaron escolares que portaban 3 distintos. Se demostró un alto grado de estabilidad de los genotipos investigados y quedó puesta de manifiesto la existencia de genotipos compartidos en escolares de ambos cent ros y por tanto una transmisión horizontal. Finalmente no se encontró asociación significativa entre el número de genotipos y los distintos indicadores de caries.