Caracterización de mutantes del gen ABCB4 asociados a enfermedades hepáticas infantiles: análisis in vitro del tratamiento con chaperonas farmacológicas

Resumen

El transportador canalicular MDR3 (ABCB4) es responsable de la secreción de fosfatidilcolina (PC) a la bilis, un proceso esencial para proteger las membranas celulares hepáticas de la acción detergente de las sales biliares. Mutaciones en el gen que la codifica (ABCB4) han sido asociadas a un amplio espectro de enfermedades hepatobiliares de distinta gravedad. Las formas más graves se manifiestan en la edad infantil y cursan con progresión a cirrosis y fallo hepático. Algunos niños afectados responden favorablemente al tratamiento crónico con ácido ursodesoxicólico (AUDC); en otros, el trasplante hepático constituye la única opción terapéutica. Se desconocen las razones de estas diferencias, aunque se ha postulado que obedecen a un distinto impacto de las mutaciones sobre la funcionalidad de MDR3. En este estudio se han identificado 18 mutaciones en ABCB4 en una cohorte de niños con fenotipos clínicos sugerentes de deficiencia de MDR3. El impacto de estas mutaciones se ha evaluado in vitro, mediante la caracterización de los niveles de expresión, localización subcelular, y actividad transportadora de PC de los respectivos mutantes. Cuatro de las mutaciones identificadas comprometen la correcta localización de MDR3 en la membrana apical; el resto afecta en distinta medida a su capacidad para transportar PC. Los resultados obtenidos se han correlacionado con los datos clínicos de los pacientes. Los niños con mutaciones que causan una pérdida total o casi total (90%) de funcionalidad de MDR3 han manifestado enfermedad hepática progresiva, refractaria al tratamiento farmacológico, que ha hecho necesaria la realización de un trasplante hepático. Aquéllos que retienen al menos un 30% de la actividad estimada de MDR3 han mostrado una respuesta favorable al tratamiento crónico con AUDC. Las mutaciones G68R, G228R, D459H y A934T conducen a una expresión predominante de la forma inmadura de MDR3 y a la retención de la proteína en el retículo endoplásmico (RE). El tratamiento con dosis farmacológicas de 4-fenilbutirato o curcumina, dos compuestos de uso clínico con actividad chaperona, es capaz de restaurar la localización en membrana de los mutantes G228R y A934T, aunque sólo para el primero se evidencia recuperación en la actividad de MDR3. En resumen, los resultados de este trabajo aportan evidencia experimental de la correlación entre el impacto de las mutaciones de ABCB4 y la evolución de la enfermedad hepática en los individuos que las portan. Para mutaciones específicas que causan la retención de MDR3 en el RE, la administración de chaperonas farmacológicas puede suponer una opción terapéutica. The canalicular membrane protein MDR3 (ABCB4) mediates the efflux of phosphatidylcoline (PC) into bile. This phospholipid is essential to protect the cellular membranes of the biliary tree from the detergent action of free bile acids. Mutations in the gene encoding MDR3, ABCB4, have been identified in association with a wide spectrum of hepatobiliary diseases. The most severe forms present in infancy or childhood with persistent cholestasis that progress to cirrhosis and liver failure. Some affected children have a favourable response to chronic treatment with ursodeoxycolic acid (UDCA); liver transplantation is the only therapeutic option for nonresponders. The reasons for these differences are unknown, but it has been hypothesized to be determined by the extent to which ABCB4 mutations compromise MDR3 function. In this study, we have identified 18 ABCB4 mutations in a cohort of children with chronic clolestasis and suspected MDR3 deficiency. These mutations have been phenotyped in vitro by assessing their effects on MDR3 expression, subcellular localization, and PC transport activity. Four mutations prevented the protein from trafficking to the apical membrane. The remaining mutations did not affect apical expression of MDR3 but impaired PCtranslocating activity to different extents. Children harbouring mutations causing complete or near-complete (90%) loss of MDR3 function developed severe liver disease refractory to pharmacological treatment and required liver transplantation. Patients who retained at least a 30% of MDR3 floppase activity favourably responded to chronic UDCA therapy. ABCB4 mutations G68R, G228R, D459H and A934T caused a predominant expression of the immature form of MDR3 and an accompanying retention of the protein in the endoplasmic reticulum. Treatment with chaperones 4-phenylbutyrate or curcumin, two clinically approved compounds, restored membrane localization of G228R and A934T mutants at pharmacological doses. However, recovery of MDR3 activity was only evidenced for G228R mutant. In summary, these data provide experimental evidence of the correlation between the impact of ABCB4 mutations and the clinical outcomes of patients harbouring such mutations. The use of pharmacological chaperones may represent a therapeutic option for patients carrying specific mutations that lead to retention of MDR3 in endoplasmic reticulum.