Synthesis and applications of biomimetic silica-based nanoparticles

Resumen

La formación controlada de estructuras inorgánicas -biomineralización- es un fenómeno biológico muy extendido en la Naturaleza, llevado a cabo por una gran diversidad de organismos, desde procariotas -por ejemplo, la síntesis de nanocristales de magnetita por bacterias magnetotácticas-, hasta el ser humano -formación de los huesos y dientes-. Entre los ejemplos más espectaculares de biomineralización se encuentra la intricada estructura de las paredes celulares de las diatomeas, algas eucariotas unicelulares presentes en hábitats marinos. Dichas paredes están compuestas de sílice hidratada amorfa, y muestran estructuras porosas jerarquizadas con dimensiones que van desde los nanómetros hasta las micras. Las nanopartículas de sílice son producidas mediante la policondensación del Si(OH)4 (ácido silícico) a un pH cercano a cinco en un compartimento intracelular específico denominado vesícula de deposición de sílice. Este proceso está controlado por proteínas y polisacáridos que actúan como plantillas para la condensación de la fase inorgánica en soluciones acuosas a temperatura ambiente. En base a este modelo, se han sintetizado nanopartículas de sílice mediante un procedimiento biomimético. Para ello, se empleó tetrametil ortosilicato (TMOS) como fuente de sílice y el polímero catiónico polietilenimina (PEI) como plantilla. La reacción de biosilificación se produce en cuestión de segundos tras la adición de TMOS hidrolizado a una disolución tampón de polietilenimina a pH neutro. El dendrímero de segunda generación PAMAM y la polilisina también fueron evaluados como moléculas plantilla para la formación de estas nanoesferas. Entre las moléculas plantilla ensayadas, la polietilenimina de 25 kDa desempeña un papel crítico en el proceso de nucleación de la fase inorgánica y, por ende, en las propiedades finales de las nanopartículas obtenidas. Las imágenes de microscopía electrónica de barrido y las medidas de dispersión de luz pusieron de manifiesto una relación exponencial entre la concentración de polietilenimina de peso molecular 25 kDa y el tamaño de partícula, variando desde 1 µm hasta 400 nm. Se estudió asimismo la influencia del peso molecular y concentración de polietilenimina, fuerza iónica del tampón, temperatura y pH sobre el tamaño de partícula. La producción de sílice se cuantificó mediante el método del molibdato azul, obteniéndose una conversión de TMOS a SiO2 cercana al 80%. Las medidas de fluorescencia y de potencial ¿ mostraron que las nanopartículas poseen una carga superficial positiva en un amplio rango de pH debido a la adsorción de una capa de polietilenimina sobre su superficie. Éstas muestran una distribución de poros mesoporosa y un área superficial de 320 m2 g-1 determinada mediante isotermas de adsorción/desorción de nitrógeno. Se ha demostrado que las nanopartículas de sílice sintetizadas biomiméticamente son capaces de encapsular de forma eficiente una amplia variedad de biomoléculas, tales como enzimas y células. La peroxidada de rábano silvestre, su forma aniónica, la D¿fructosa dehidrogenasa, la tirosinasa y la glucosa oxidasa fueron inmovilizadas, mostrando una mayor estabilidad temporal frente a la correspondiente en tampón. Se determinó del mismo modo el efecto del ratio de concentraciones tetrametil ortosilicato: polietilenimina y de la elección del agente lavador -agua o NaCl- sobre la eficacia en la inmovilización de enzimas. Siguiendo el protocolo de síntesis descrito, células de Gluconobacter oxydans fueron recubiertas con sílice permitiendo la oxidación de glicerol a dihidroxiacetona por acción de la enzima de membrana glicerol dehidrogenasa-pirroloquinonina quinona. El ensayo MTT fue empleado para determinar su actividad enzimática en función de la temperatura y pH. La matriz de sílice proporciona una mayor termoestabilidad a las células bacterianas al tiempo que éstas preservan su actividad. Por último, con objeto de integrar las nanopartículas silíceo-enzimáticas en superficies transductoras para la construcción de biosensores, se plantearon dos posibles alternativas. En primer lugar, la deposición de nanopartículas de sílice modificadas con la forma aniónica de la peroxidada de rábano silvestre sobre electrodos de grafito dirimió en bioelectrocatálisis directa a 0 mV vs. Ag|AgClsat. En segundo lugar, se desarrolló una novedosa estrategia de inmovilización basada en la generación in situ de biosilicatos sobre electrodos de oro previamente modificados con una monocapa autoensamblada de polietilenimina. Las medidas de microbalanza de cristal de cuarzo y las imágenes de microscopía electrónica de barrido corroboraron la encapsulación de la forma aniónica de la peroxidasa sobre la superficie de oro. Esta metodología permitió la bioelectrocatálisis directa de la enzima con la superficie electródica a 0 mV vs. Ag|AgClsat.