Cryptosporidium y giardiaestudio sobre su presencia y diversidad genética en hospedadores naturales e importancia del agua como vía de transmisión

Resumen

Cryptosporidium y Giardia son los protozoos de transmisión hídrica más frecuentes en países desarrollados. A su importancia económica como microorganismos causantes de diarrea neonatal y retraso del crecimiento en diferentes especies ganaderas, cabe añadir las repercusiones derivadas del carácter zoonótico de algunas especies y genotipos de ambos patógenos. En el presente trabajo de investigación se aborda un estudio para analizar la diversidad genética y el potencial zoonótico de aislados de Cryptosporidium en hospedadores naturales afectados de diarrea y considerados los principales reservorios del parásito en la naturaleza, entre los que se incluye el hombre y diversas especies de rumiantes domésticos (terneros, corderos). En una segunda fase se analiza la importancia del agua como vehículo de transmisión de Cryptosporidium y Giardia en nuestro entorno geográfico. El trabajo de investigación se ha desarrollado a lo largo de seis objetivos, cada uno de los cuales ha dado lugar a la publicación de un artículo de investigación original en una revista indexada en J.C.R. En el primero de los artículos, publicado en la revista “Veterinary Parasitology”, se ha optimizado una técnica de análisis de fragmentos para diferenciar en una misma reacción las especies y subtipos de C. parvum más frecuentes en rumiantes domésticos, con el fin de utilizarla en el desarrollo de alguno de los restantes objetivos. La técnica constituye una herramienta discriminatoria y una alternativa económica a la secuenciación, además de ser de ejecución más rápida. Para ello se utilizó un panel de muestras de ADN formado por seis especies de Cryptosporidium (C. parvum, C. bovis, C. ryanae, C. andersoni, C. ubiquitum, and C. hominis) y 18 subtipos de C. parvum pertenecientes a las familias IIa y IId, todas las cuales habían sido caracterizados previamente mediante secuenciación de los genes SSUrRNA y GP60. Para la amplificación de ambos marcadores se diseñaron nuevos cebadores, con el fin de obtener fragmentos de diferente tamaño para cada una de las especies y subtipos. La técnica optimizada permitió diferenciar todas las especies de Cryptosporidium, salvo C. bovis y C. ryanae, así como la mayoría de subtipos (11/18), aunque en algunos de las subfamilias IIa y IId se observó solapamiento del tamaño. La validación posterior de la técnica en un panel de aislados de C. parvum de terneros (n: 123) y corderos (n: 113) permitió diferenciar un total de 10 alelos, de los que únicamente tres eran compartidos entre ambos hospedadores. En un segundo artículo, publicado en la revista “Infection, Genetics and Evolution” se recogen los resultados de un estudio multilocus para investigar la diversidad inter- e intra-específica de Cryptosporidium en pacientes pediátricos de la ciudad de Zaragoza, en base a la secuenciación de dos genes (SSU rRNA y GP60) y una técnica de análisis de fragmentos con 8 marcadores con un número variable de repeticiones en tándem (variable-number tándem-repeat = VNTR), también denominados microsatélites y minisatélites. El análisis reveló que la transmisión de Cryptosporidium es principalmente antroponótica en la zona de estudio, con claro predominio de C. hominis (n: 41) sobre C. parvum (n: 3) y la presencia de cuatro subtipos (IbA10G2, IaA24R3, IIaA15G1R1 y IIaA15G2R1), si bien la mayoría de aislados fueron asignados al primero. Cinco de los marcadores VNTR fueron más discriminatorios que la GP60, aunque todos ellos presentaban un alelo predominante, exhibido por al menos la mitad de los aislados. Todos los alelos identificados, con excepción de cuatro, fueron distintivos de la especie de Cryptosporidium y algunos estaban aparentemente ligados. La identificación del subtipo multilocus (MLT) de cada aislado, en base a la combinación de alelos en los distintos marcadores, incrementaba de forma considerable el índice discriminatorio (índice de Hunter-Gaston: 0,807) y reveló una diversidad genética muy superior a la GP60. Concretamente, se identificaron 17 MLTs, aunque uno de ellos era distintivo de casi la mitad de los aislados. El estudio filogenético y de genética de poblaciones demostró que los aislados de C. hominis mantienen una estructura predominantemente clonal en la zona de estudio y segregan de acuerdo con el subtipo GP60, lo que confirma la idoneidad de este marcador para diferenciar subpoblaciones. En los artículos tercero y cuarto, ambos publicados en la revista “PLoSOne”, se recogen sendos estudios epidemiológicos para investigar la variabilidad genética de aislados de C. parvum en terneros y corderos lactantes con diarrea procedentes de explotaciones del norte de España, respectivamente. En ambos casos se utilizó una técnica de análisis de fragmentos con un total de 11 marcadores VTNR, algunos de ellos de nueva descripción, que se combinó con el gen GP60 para identificar el MLT de cada aislado. El estudio en ganado vacuno fue realizado sobre aislados de 123 terneros procedentes de 31 explotaciones lecheras del País Vasco, Cantabria y Asturias. En el caso del ganado ovino se utilizaron aislados de 113 corderos seleccionados en 49 explotaciones del nordeste de nuestro país. El estudio multilocus reveló importantes diferencias en función del hospedador de procedencia de los aislados, que afectaban tanto al poder discriminatorio de los diferentes marcadores como a los alelos más prevalentes en muchos de ellos. La combinación de alelos de los 12 loci reveló el gran poder discriminatorio de la técnica multilocus (índice de Hunter-Gaston: 0,987 y 0,988 en terneros y corderos, respectivamente) y permitió diferenciar un elevado número de MLTs en terneros (n: 70) y corderos (n: 74). La mayoría de MLTs (54 y 64, respectivamente) fueron distintivos de determinadas explotaciones y de todos ellos solamente uno fue compartido por ambos hospedadores (MLT-27 en terneros y MLT-2 en corderos), todo lo cual evidencia el carácter endémico de la criptosporidiosis en las explotaciones de rumiantes. No obstante, en un elevado porcentaje de las explotaciones donde se analizaron más de dos muestras, tanto en ganado vacuno (19/21) como ovino (28/46), se observó la coexistencia de varios MLTs, lo cual sugiere que las mutaciones o el intercambio genético mediante recombinación son frecuentes. El análisis de poblaciones indicó que la mayoría de MLTs de terneros están asignados a dos grupos de complejos clonales relacionados por variantes de un solo locus (SLVs), con una estructura predominantemente panmíctica, mientras que la divergencia genética fue muy superior entre los aislados de origen ovino, muchos de los cuales no estaban relacionados por SLVs y en los que se observó tendencia a la clonalidad. Las dos últimas publicaciones, ambas en la revista “Science of the Total Environment”, contienen los resultados de sendos estudios para investigar la importancia del agua como vehículo de dispersión de Cryptosporidium y Giardia en la comunidad autónoma de Aragón. Para ello, se seleccionaron los municipios con un censo superior a 5.000 habitantes, donde se analizaron muestras del afluente y efluente de 20 estaciones de tratamiento de agua potable (ETAPs) y 23 estaciones de depuración de agua residual (EDARs), a lo largo de las cuatro estaciones del año. En estas últimas también se analizó una muestra de lodos deshidratados. Tanto la toma de muestras como su análisis se realizó según el método USEPA 1623. En un alto porcentaje de ETAPs se identificaron ooquistes de Cryptosporidium (55%) y quiste de Giardia (70%), destacando nueve plantas que fueron positivas a ambos parásitos y solo cuatro que se mantuvieron negativas durante todo el periodo de estudio. La concentración de (oo)quistes no estuvo relacionada con la turbidez, con valores promedio en el agua de entrada que alcanzaron 67 ooq./100 l. y 125 quistes/100 l. Tampoco se pudo establecer una relación entre el tipo de tratamiento aplicado en la planta y la eficacia de retención de ooquistes. De hecho, el agua de salida fue positiva a Cryptosporidium y Giardia en tres y nueve ETAPs, respectivamente, con una concentración media de 88 ooq./100 l. y de 37 quistes/100 l., la mayoría de los cuales fueron considerados potencialmente viables. Estos hallazgos confirman la ineficacia de los tratamientos convencionales del agua para reducir o inactivar la totalidad de (oo)quistes y ponen de manifiesto el riesgo sanitario que esto plantea. El estudio en plantas depuradoras confirmó la ubicuidad y elevado grado de contaminación por ambos patógenos en las aguas residuales. Concretamente, la totalidad de muestras (184) fueron positivas a Giardia, con una concentración media que superaba los 3.000 quistes/l. a la entrada y 50 quistes/l. a la salida. Cryptosporidium también fue identificado en la mayoría de muestras tomadas tanto en la entrada (85/92) como en la salida (78/92) de las EDARs, aunque la concentración en este caso fue significativamente menor (96 y 31 ooq./l., respectivamente) (P<0.001). La eficacia media de retención de las plantas de tratamiento fue superior para Giardia (entre 1,06-log y 2,34-log) que para Cryptosporidium (entre 0,35-log y 2,34-log). La mayoría de muestras de lodo deshidratado también fueron positivas a Giardia (92/92) y Cryptosporidium (45/92), con una concentración media de 20-593 quistes/gr. y 2-44 ooq./gr. La caracterización molecular de las muestras positivas a Giardia reveló la presencia del sub-ensamblaje AII en todas las plantas, aunque en muchas muestras se identificaron ensamblajes mixtos (AII+B). Asimismo, se detectaron nueve especies de Cryptosporidium y seis subtipos de C. parvum y C. hominis, siendo los subtipos IIaA15G2R1 y IbA10G2 los más prevalentes. La presencia de una concentración relativamente alta de (oo)quistes en los efluentes finales de las plantas depuradoras y en los lodos deshidratados demuestra la limitada eficacia de los tratamientos de depuración convencionales y pone de manifiesto el impacto ambiental potencial y los riesgos para la salud pública asociados con la eliminación y reutilización de aguas residuales.