Desarrollo de biosensores ópticos autoindicadores basados en las propiedades ópticas intrínsecas o inducidas de oxidasas y hemoproteínasdiseño, puesta a punto e implementación de esquemas de detección alternativos

Resumen

En esta tesis doctoral se ha planteado, como objetivo general, el desarrollo de nuevas alternativas metodológicas que permitan ampliar el abanico de esquemas de detección disponibles para el diseño y puesta a punto de biosensores ópticos reversibles. La investigación va acompañada de un estudio teórico, ya que los métodos se han desarrollado con el objetivo de que puedan ser ampliados a otros analitos involucrados en reacciones similares. A lo largo de ella se han desarrollado metodologías basadas principalmente en la fluorescencia molecular intrínseca o inducida a flavoenzimas y hemoproteínas. En particular se presenta: 1. El estudio y desarrollo de un método para la determinación de colina basado en la fluorescencia intrínseca de la Colina Oxidasa (ChOx) debida a su cofactor FAD, para la determinación de colina y betaína aldehído, tanto de forma individual como simultanea. Así mismo, se propone un mecanismo cinético de la reacción enzimática, que ha sido validado a partir del desarrollo de un modelo teórico que permite estimar las constantes cinéticas del proceso y las variables que influyen en él. 2. El desarrollo de un método, alternativo al anterior, para la determinación de colina y betaína aldehído basado en la fluorescencia inducida a la ChOx a través de su modificación química con un derivado de rutenio. A partir de este método se ha llevado a cabo el desarrollo de un biosensor óptico para la determinación de colina. 3. Utilizando la misma metodología, se presenta el desarrollo de un método enzimático para la determinación de peróxido de hidrógeno basado en la fluorescencia inducida de una hemoproteína, como es la catalasa, químicamente modificada con el derivado de rutenio (Cat-Ru) y, a partir de él, su implementación al desarrollo de un biosensor óptico para la determinación de este analito. A su vez, se ha realizado un estudio teórico de la señal de fluorescencia a fin de definir las expresiones matemáticas que modelan las señales obtenidas, permitiendo así predecir el efecto de las diferentes variables químicas e instrumentales en la señal analítica. Adicionalmente, el biosensor de Cat-Ru ha sido utilizado para desarrollar sistemas de detección alternativos, que permitan abrir nuevas posibilidades en el campo de los biosensores ópticos. En concreto: el análisis de imagen, a partir de la coordenada R del espacio RGB de la membrana biosensora de Cat-Ru o el acoplamiento de esta membrana a un sensor óptico de O2 comercial. 4. A partir de las propiedades de absorción de las hemoproteínas, se ha diseñado un biosensor para la determinación de peróxidos en aceites vegetales basado en la peroxidasa. El método ha sido aplicado en distintos tipos de aceites de consumo con resultados satisfactorios en la mayoría de los casos.