Desarrollo de una metodología que mejora la integridad y fertilidad de espermatozoides sexados de bovino

Resumen

It has been three decades since gender pre-selection of the offspring using flow cytometry was proven possible. In this time, two of the most cited issues have been the reduced sperm integrity and fertility of sex-sorted sperm compared to conventional (non-sorted) semen. This dissertation investigates the effects of biological, physical and chemical factors involved in the process of bovine sperm sex-sorting, to update the existing methodology and provide a supportive environment that improves sperm integrity and function throughout the process. A series of experiments was carried out with the objective of understanding the effects of bacteria (Chapter 1), pH (Chapter 2), temperature (Chapter 3) and antioxidant supplementation (Chapter 4) on sperm function. The results of these experiments demonstrated that: 1) bacterial presence adversely affects sperm DNA integrity, 2) pH fluctuations of the extenders, especially those related to acidic environments, negatively influence sperm survival, motility and DNA integrity, 3) a storage temperature of 18 °C allows for sperm to retain their quality, and 4) appropriate antioxidant support in the semen extenders maintains optimal sperm health throughout the process. The results were combined in an overall improvement of the conditions for bovine sperm processing, sex-sorting and cryopreservation in a new methodology that received the trade name SexedULTRA™. The function of sperm processed following the SexedULTRA™ method was compared with the previous method (XY), as well as with conventional semen, by comparing in vitro sperm characteristics and fertilizing ability (Chapter 5). The objective was to measure the effects of the SexedULTRA™ method, hypothesizing that the new methodology would improve sperm integrity and longevity. The results indicated that sperm processed following the SexedULTRA™ method had improved in vitro characteristics and competence to complete fertilization compared to sperm processed using XY and conventional methods. Lastly, the fertility of sperm processed under the SexedULTRA™ method was assessed in vivo in two large scale field trials (Chapter 6), with the objective of confirming that the improvements to sperm function observed in vitro when using the SexedULTRA™ method, also resulted in higher conception rates compared to sperm processed using the XY method. An ancillary objective was to examine if the difference in fertility between conventional and sex-sorted sperm could be eliminated by increasing the insemination dose. The results confirmed that the SexedULTRA™ method improves conception rates of sex-sorted bovine sperm, and that a higher sperm dose per insemination provides parity in field fertility with conventional sperm. The work presented in this dissertation confirms that the issues related to bovine sperm sex-sorting can be mitigated by the advances made with the SexedULTRA™ method, which confers a significant benefit in maintaining sperm integrity, as well as in vitro and in vivo fertility. ------ Han transcurrido tres décadas desde que se demostró que la preselección del género de la descendencia mediante citometría de flujo era posible. En este tiempo, dos de los problemas más citados han sido la reducida calidad y fertilidad de los espermatozoides sexados en comparación con aquellos procesados mediante métodos convencionales (no sexados). Esta tesis doctoral se ha enfocado en investigar el efecto de factores biológicos, físicos y químicos involucrados en el proceso de sexado de espermatozoides de bovino, con el objetivo de actualizar la metodología existente y proporcionar un entorno que mejore la integridad espermática a lo largo del proceso. Se realizó una serie de experimentos con el objetivo de evaluar el efecto de la presencia bacteriana (Capítulo 1), el pH (Capítulo 2), la temperatura (Capítulo 3) y la suplementación con antioxidantes (Capítulo 4) sobre la integridad de los espermatozoides. Los resultados de estos experimentos demostraron que: 1) la presencia bacteriana afecta negativamente a la integridad del ADN espermático, 2) las fluctuaciones del pH de los diluyentes aumentan el porcentaje de espermatozoides muertos y disminuyen la motilidad y la integridad del ADN, 3) una temperatura de 18 °C permite que las células espermáticas retengan su función, y 4) la adición de agentes antioxidantes a los diluyentes mantiene la integridad de los espermatozoides a lo largo del proceso de sexado. Estos resultados dieron lugar a una mejora de las condiciones de manipulación, sexado y criopreservación de los espermatozoides de bovino, en una nueva metodología denominada comercialmente SexedULTRA™. La función de los espermatozoides procesados mediante el método SexedULTRA™ se comparó con el anterior método (XY), así como con semen convencional, mediante el análisis in vitro de parámetros de calidad y fertilidad espermática (Capítulo 5). El objetivo fue medir los efectos del método SexedULTRA™, con la hipótesis de que mejoraría la integridad y longevidad de los espermatozoides. Los resultados demostraron que los espermatozoides procesados con el método SexedULTRA™ presentan mejor calidad, así como una mayor producción de embriones in vitro, en comparación con espermatozoides procesados mediante los métodos XY y convencionales. Finalmente, la fertilidad de los espermatozoides procesados bajo el método SexedULTRA™ se evaluó in vivo mediante dos pruebas de campo (Capítulo 6), con el objetivo de confirmar que las mejoras observadas in vitro al utilizar el método SexedULTRA™ se reflejaban en tasas de concepción más altas. El objetivo adicional fue examinar si la diferencia de fertilidad entre espermatozoides convencionales y sexados podría eliminarse aumentando la dosis de inseminación. Los resultados confirmaron que el método SexedULTRA™ aumenta la fertilidad de espermatozoides sexados y que, mediante el uso de una dosis más elevada de inseminación, se alcanza paridad en las tasas de concepción en comparación con el semen convencional. El trabajo presentado en esta tesis doctoral confirma que los problemas relacionados con el sexado de espermatozoides se pueden mitigar mediante las mejoras realizadas en el método SexedULTRA™, el cual confiere un beneficio significativo al mantenimiento de la integridad de las células espermáticas, y a la fertilidad in vitro e in vivo.