Establecimiento y caracterización biológica de una nueva línea celular de estirpe glial

Resumen

Los gliomas malignos son el tipo más común de tumor cerebral primario, con 12.000 nuevos casos diagnosticados cada año en los Estados Unidos. Durante casi un siglo los gliomas malignos se han clasificado, según características histológicas, en astrocitomas (incluidos los glioblastomas), oligodendrogliomas, ependimomas y gliomas mixtos. Desafortunadamente, la distinción microscópica entre los oligodendrogliomas de alto grado y los glioblastomas es problemática, ya que estos dos tipos de glioma maligno pueden compartir características histológicas tales como contener células pequeñas, poseer proliferación vascular y sufrir necrosis. Estos problemas plantean la cuestión de si el diagnóstico histológico puede ser mejorado de una manera clínicamente útil. El objetivo principal de este trabajo ha sido conseguir una fuente de tejido tumoral en un entorno vivo, así como unas poblaciones celulares estandarizadas, que mantengan la variedad de características iniciales y posibiliten el estudio de la transformación neoplásica de las células gliales, identificando el papel de las células madre tumorales en ese proceso. Para llevar a cabo nuestro proyecto, usamos el modelo experimental combinado de xenoinjertos en ratón atímico nude a partir de tumores primarios gliales y cultivos celulares establecidos a partir de las poblaciones celulares tumorigénicas extraídas de los anteriores xenoinjertos tumorales. Estudiamos los xenotransplantes desarrollados en ratones nude, gliomas primarios obtenidos de pacientes y oligodendrogliomas inducidos en ratas Sprague-Dawley mediante la administración transplacentaria de N-etil-N-nitrosourea (ENU). De todos ellos, sólo cuatro mostraron la tumorigenicidad requerida para que se desarrollaran tumores a partir de los cuales realizar sucesivos pases, GLI 6, GLI 7A, OLIGO 2 y OLIGO 5. De estos cuatro tumores, los humanos (GLI 6 y GLI 7A) presentaron una capacidad tumorigénica limitada, con periodos de latencia y desarrollo bastante largos. A pesar de ello, pudimos estudiar algunas de sus características, que los hacían compatibles con su diagnóstico inicial de astrocitoma anaplásico y glioblastoma multiforme, respectivamente. El caso GLI 7A presentó mayor tumorigenicidad, de modo que analizamos su especie de origen, que resultó ser ratón y no humano como el tumor primario inoculado. De manera que este tumor desarrollado probablemente resultó de la transformación neoplásica del estroma del ratón huésped. Los tumores inducidos experimentalmente (OLIGO 2 y OLIGO 5) fueron muy similares en todas sus características tumorales, tanto macroscópicas como microscópicas. Los xenoinjertos iniciales se mantuvieron tras sucesivas reinoculaciones, lo que nos permitió establecer cultivos celulares a largo plazo del caso OLIGO 2 y obtener una línea celular tumoral de estirpe glial. Esta línea tumoral, aunque mantenía muchas características típicas de los tumores gliales, también presentó un patrón de comportamiento propio. La línea celular OLIGO 2 reveló una especie de origen que fue rata (Rattus norvegicus), como el tumor primario del que derivaba, mediante un cariotipado y dos PCR, una donde identificamos secuencias ID de especies murinas y una PCR anidada muy específica y capaz de distinguir muestras celulares de entre una gran variedad de especies. Caracterizamos la línea celular OLIGO 2, mediante proteínas marcadoras que nos revelaron una heterogeneidad celular, mayor en los xenoinjertos que en los cultivos celulares. También confirmamos la estirpe glial (N-cadherina, PDGFRa) de la línea y el estadío indiferenciado, cercano a las células madre gliales (nestina, A2B5), en el que se encontraba la mayoría de sus células. Esta línea tenía una gran capacidad proliferativa, demostrada mediante la expresión positiva del marcador Ki-67 y fue relativamente dependiente del suero fetal bovino para su proliferación. Llevamos a cabo una diferenciación parcial de la línea celular OLIGO 2, mediante un protocolo combinado de ausencia de suero fetal bovino y adición de factores tróficos (glucosa y la mezcla insulina-transferrina-selenio) y diferenciadores (dexametasona) en el medio de cultivo. Estas células diferenciadas se caracterizaron por una capacidad proliferativa mucho menor y la nula expresión del marcador Ki-67. Las células adquirieron un patrón morfológico diferenciado, típico de astrocitos u oligodendrocitos prematuros. Este patrón morfológico diferenciado se vió confirmado por marcadores típicos de células más diferenciadas de la estirpe glial, como son O4 y GFAP.