Base genética del tropismo de lentivirus de pequeños rumiantes y estudio de la resistencia innata por APOBEC3

Resumen

Los lentivirus de pequeños rumiantes (SRLV), que incluyen al virus Visna/Maedi (VMV) y al de la artritis encefalitis caprina (CAEV), infectan ovejas y cabras distribuidas por todo el mundo causando un cuadro multisistémico que afecta articulaciones, pulmones, glándula mamaria y sistema nervioso central. Las pérdidas derivadas de la infección van desde el aumento en la tasa de reposición, a un descenso en las producciones animales o en el valor comercial del rebaño. Aunque la enfermedad causada por los SRLV es de carácter lento y generalmente afecta a pulmones y glándula mamaria en nuestro país, se han descrito brotes epidemiológicos causantes de artritis y encefalitis en ovinos que afectan un gran número de animales, causando pérdidas directas. En la actualidad existen 5 genotipos descritos (A-E) que presentan una alta variabilidad genética y biológica. Los genotipos A y B a los que pertenecen las estirpes clásicas de VMV y CAEV respectivamente, están distribuidos mundialmente, mientras que los genotipos C y E están restringidos a zonas geográficas concretas. En ausencia de tratamientos o vacunas totalmente protectoras, las medidas de control se basan en la detección temprana de animales infectados y su posterior eliminación del rebaño. Tras la infección, los animales infectados desarrollan una respuesta de anticuerpos que, si bien no es capaz de eliminar el virus, es indicadora de la infección. Así, empleando métodos de detección serológica podemos diagnosticar la infección indirectamente. Los métodos más eficaces hasta el momento son los ELISAs basados en proteínas recombinantes y péptidos sintéticos. Sin embargo, los métodos disponibles en el comercio están diseñados teniendo en cuenta una única estirpe viral, que sumado a la alta variabilidad antigénica de los SRLV, hace que las medidas disponibles fallen a la hora de controlar todo el espectro antigénico presente. La organización genómica de los lentivirus está bastante conservada entre los miembros del género. Así, a los genes estructurales gag, pol y env encargados de codificar proteínas de la cápside, proteínas para la replicación del material genético e integración y las proteínas de la envoltura, respectivamente, hay que sumarles los accesorios vpr, rev y vif en el caso de los SRLV, todos ellos flanqueados por el regulador de la transcripción viral, la región LTR. En la patogénesis de las enfermedades lentivirales es esencial conocer las interacciones entre el virus y el hospedador que determinan el tropismo y el desarrollo de los síntomas. Los factores virales incluyen las proteínas de la envoltura, encargadas de unirse al receptor celular y la región LTR encargada de regular la actividad transcripcional. Los factores del hospedador son más diversos ya que pueden incluir todo el fondo genético de una raza o una población determinada capaz de restringir la replicación viral de manera efectiva. Uno de los pasos clave en el establecimiento de la infección es la superación de las barreras de la inmunidad innata, que reconocen directamente determinantes virales e inducen la eliminación del patógeno mediante factores de restricción como APOBEC3. La caracterización genética y virológica de las estirpes implicadas en los brotes epidemiológicos de artritis y encefalitis, puede aportar hallazgos esenciales en el conocimiento de la relación entre la secuencia genética de los aislados y la capacidad para establecer la infección en un tejido determinado. Por otro lado, componentes de la inmunidad innata del hospedador capaces de inhibir la replicación viral pueden ser también determinantes del tropismo. Por todo ello en esta tesis nos planteamos los siguientes estudios: a) Aislamiento y caracterización genética de estirpes implicadas en el brote artrítico. En España se han detectado los primeros casos de artritis en ovinos aunque hasta el momento las secuencias encontradas tanto en ovinos como en caprinos son del tipo virus Visna/Maedi (VMV). Teniendo en cuenta que la artritis es un signo más abundante entre cabras infectadas, es importante determinar si la secuencia genética del virus implicado en la artritis ovina es similar al virus de la artritis encefalitis caprina (CAEV). Las secuencias encontradas en los animales afectados se agrupaban en el genotipo B2 de SRLV (tipo CAEV), sugiriendo una posible asociación entre el grupo genético y la patología inducida. Además, se obtuvo un aislado cuyo genoma completo semejaba las estirpes de CAEV siendo sólo la integrasa de tipo VMV. Aunque la región LTR no contenía repeticiones y una deleción en la región R, propuestas como atenuantes de la replicación, el fenotipo observado en cultivos de fibroblastos de piel ovinos fue rápido/alto. El estudio de este brote epidemiológico representa la primera descripción de secuencias de tipo CAEV en ovinos así como la primera estirpe aislada de SRLV en España. b) Aislamiento y caracterización genética de estirpes implicadas en el brote de encefalitis. Se ha descrito un brote extenso en ovinos caracterizado por la presencia de síntomas neurológicos en España. No se conocen las características de los virus implicados y tampoco se dispone de herramientas diagnósticas específicas para dicho brote. Los animales presentaron lesiones en la médula espinal, hecho diferencial del brote, de los que aislamos una estirpe representativa. Las secuencias obtenidas fueron asignadas al genotipo A2/A3 al que pertenecen otras estirpes causantes de encefalitis. La región LTR carecía de repeticiones pero la actividad transcripcional en fibroblastos ovinos resultó ser alta. Sin embargo, los estudios in vitro revelaron que la producción viral fue lenta/baja en fibroblastos ovinos pero alta en macrófagos derivados de monocitos sanguíneos. Así, parece que la replicación viral no puede deducirse de la actividad transcripcional del LTR y su asociación puede no ser correcta. Un análisis de los epitopos inmunodominantes de la envoltura de los SRLV implicados en el brote y de otros descritos, condujo al diseño de un péptido sintético con el que desarrollamos un ELISA capaz de detectar los animales afectados por el brote de encefalitis, pero no los afectados por otras formas de la enfermedad. Así generamos una herramienta diagnóstica específica de interés epidemiológico para controlar la diseminación de estas estirpes altamente patogénicas. c) Caracterización de la restricción de los SRLV por APOBEC3. Los factores intrínsecos de la inmunidad innata incluyen la apolipoprotein B editing enzyme catalytic polypeptide-like 3 (APOBEC3) que inhibe la replicación viral por diferentes mecanismos, incluyendo la desaminación de citosinas del DNA viral. Los ovinos contienen tres genes APOBEC3 que codifican cuatro proteínas (A3Z1, A3Z2, A3Z3, A3Z2Z3) con características antivirales aún desconocidas. Empleando monocitos y macrófagos derivados de monocitos sanguíneos, caracterizamos en este trabajo un descenso acusado en la expresión de A3Z1 que coincide con un aumento significativo de la replicación viral. El análisis de los transcritos de A3Z1 reveló la presencia de variantes derivadas de splicing (A3Z1Tr) que carecían del dominio citidín desaminasa, responsable de la actividad enzimática. Células homólogas (fibroblastos ovinos) transfectadas con A3Z1 mostraron una reducida producción viral tras la infección con SRLV en comparación con A3Z1Tr. A pesar de ello, no se encontraron signos evidentes de desaminación en las secuencias virales obtenidas. Se detectaron variantes derivadas de splicing equivalentes en células humanas y de mono, generalizando la presencia de proteínas A3 truncadas derivadas de splicing en primates. La restricción global mediada por A3Z1 podría estar regulada por la expresión génica de isoformas truncadas derivadas de splicing que carezcan del dominio citidín desaminasa.